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sido la Resonancia Magnética Nuclear (RMN). Ya desde
los años 70, la labor de grupos como el de Kurt Wüthrich
(Premio Nobel de Química en 2002), en el ETH de Zurich,
pusieron las bases para la determinación de la estructura
tridimensional con resolución atómica de proteínas (y otras
macromoléculas) en solución mediante RMN. El principio
de esta técnica espectroscópica es la determinación de
distancias inter-atómicas y de ángulos dihédricos, entre
otros parámetros, para modelar una estructura en base a las
restricciones estructurales obtenidas, y Wüthrich la utilizó gracias a los enlaces de carácter débil que se producen en
para determinar en 1982 la estructura atómica del inhibidor
de la tripsina pancreática (18). Sin embargo, las
capacidades de la RMN, más allá de la pura determinación
estructural, han hallado su área de aplicación en los
estudios de dinámica estructural, plegamiento de proteínas
y, muy especialmente, en el análisis de interacciones. No
obstante, a pesar de sus enormes potencialidades, el uso de
la RMN ha estado limitado a sistemas de relativa baja
masa molecular y ha estado tradicionalmente penalizado
por sus largos tiempos de recolección de datos y de
resolución de estructuras, si bien se está avanzando
considerablemente en todos estos aspectos y, actualmente
presenta un futuro muy prometedor.
Mientras que la difracción de rayos X comenzaba a ser
utilizada para el análisis de muestras biológicas, otra
técnica, la microscopía electrónica, nacía a resultas de los ello se idearon técnicas de “moldeado” (22-24) en las que
desarrollos teóricos producidos durante la misma
revolución que tuvo lugar en la Física. Su concepción parte
de los estudios de Louis de Broglie (Premio Nobel de
Física de 1929), quien formuló la teoría de que los
electrones tienen una naturaleza dual corpúsculo/onda. La
confirmación de estos estudios tuvo unos claros efectos
prácticos: los electrones podían interaccionar con la
materia –y por lo tanto extraer información de ésta- y ser
manejados mediante dispositivos electromagnéticos.
Durante los siguientes años, principalmente en Alemania y
alrededor de un grupo de la universidad de Berlín liderado
por Max Knoll, del que su estudiante de doctorado Ernst
Ruska sería el mayor activo, se desarrollaron las primeras
lentes electromagnéticas y unos primitivos sistemas de
vacío que permitieron generar imágenes en un
rudimentario microscopio electrónico de transmisión
construido por el grupo en 1931 (19). No se tardó mucho
tiempo en utilizar los primeros microscopios electrónicos
para observar muestras biológicas, en concreto de virus y
bacterias, de la mano de Helmut Ruska, hermano de Ernst
(20).
El desarrollo de los microscopios tuvo como mejora
fundamental el aumento de voltaje, que posibilitó el uso de
radiaciones de longitud de onda más corta y por lo tanto
una mayor capacidad de resolución. Un microscopio
electrónico de 200 kV emite electrones con una longitud
de onda de 0,025 Å y por lo tanto es capaz en principio de
resolver detalles subatómicos de las moléculas bajo
estudio. Esto es casi cierto desde hace tiempo en el área de procesamiento de imagen, que aplicaron en un principio a
Materiales, en el que se estudian estructuras compuestas
fundamentalmente de elementos pesados que interaccionan
entre sí a través de enlaces fuertes: las muestras pueden
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José María Valpuesta, José L. Carrascosa
irradiarse sin mucho problema y además producen mucho
contraste –dispersan más los electrones-(21). En la
práctica, y en el campo de la Biología, esto distaba mucho
de ser posible hasta hace unos pocos años. El problema
fundamental cuando se trabaja con una muestra biológica
es que su estructura tridimensional se conserve mientras es
irradiada, y es que esa estructura se mantiene como tal
su interior y con las moléculas de agua que las solvatan, y
estos enlaces son destruidos rápidamente por la radiación
electrónica. El agua por lo tanto debe mantenerse presente
si se quiere tener una imagen fiel de la muestra. Esto
representa un problema, pues el microscopio electrónico
requiere trabajar en condiciones de alto vacío para que los
electrones –que interaccionan fuertemente con la materia-
atraviesen la columna del microscopio electrónico, irradien
la muestra y sean dispersados por ella. El vacío del
microscopio haría desaparecer el agua de la muestra –y, de
hecho, toda la muestra-. Mantener pues la muestra
biológica hidratada dentro del microscopio electrónico
parecía una quimera y los investigadores, desde los
trabajos pioneros de Helmut Ruska, se dedicaron a intentar
remover el agua de las muestras sin que el proceso de
deshidratación afectase demasiado a su estructura. Para
el agua es reemplazada por un material que no sólo es más
resistente a la radiación sino que también genera más
contraste. Estas técnicas son muy agresivas para la muestra
y limitan mucho la resolución a la que se las puede
analizar, pero facilitaron durante esos años iniciales la
visualización de estructuras biológicas (tejidos, células,
organelos subcelulares, bacterias, virus, …). Como
ejemplo, sirvan los estudios de Albert Claude, Christian de
Duve y George Palade (Premios Nobel de Medicina o
Fisiología de 1974) que permitieron describir la estructura
de la célula y sus distintos organelos (25,26), o los de
Hugh Huxley en el Laboratory of Molecular Biology que
ayudaron a comprender el mecanismo de contracción del
músculo (27). La microscopía electrónica vivió durante el
segundo tercio del siglo XX una era dorada como técnica
descriptiva, pero durante ese tiempo se realizaron también
los primeros estudios que mostraron que dadas las
condiciones adecuadas, y mediante técnicas de
procesamiento de imagen, se podía recuperar información
sobre la estructura tridimensional de las moléculas
biológicas bajo estudio. En este campo sobresale la figura
de Aaron Klug (Premio Nobel de Química de 1982),
también en el Laboratory of Molecular Biology. Klug y
colaboradores desarrollaron durante la década de los 60 la
teoría de la imagen que se produce en un microscopio
electrónico. Estos estudios demostraron que la información
que se registra corresponde a la proyección del espécimen,
en definitiva que existe información tridimensional y que
ésta se puede recuperar mediante técnicas de
especímenes regulares como virus icosaédricos o colas de
bacteriófagos (28-30). Utilizando estas técnicas y en
colaboración con David de Rosier, Klug publicó la primera
reconstrucción tridimensional de una estructura biológica,
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