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Estudio
de
la
actividad
neuroprotectora
de
diterpenos…

incubación,
las
células
se
lavan
2
veces
con
medio
de
Krebs
sin
calcio
y
sin
sonda

fluorescente
y
se
dejan
incubar
durante
30
minutos
a
la
misma
temperatura
para

permitir
la
hidrólisis
completa
del
éster.
La
fluorescencia
se
mide
a
37ºC
durante
5

minutos
a
una
?excitación
de
552
nm
y
a
una
?emisión
de
581
nm
a
37ºC
en
un

fluorímetro
Spectramax
Gemini
EM
(Molecular
Devices).
A
continuación,
se

adiciona
el
ionóforo
A23187
(5
µM)
y
se
mide
la
fluorescencia
durante
15
minutos

en
las
mismas
condiciones
descritas
anteriormente
(25).

2.4.
Métodos
para
el
estudio
de
paso
a
través
de
BHE

-­-
Estudios
de
permeabilidad.
El
experimento
de
transporte
se
inicia
con
la

adición
de
los
diterpenos
en
un
volumen
de
0,5
mL
en
el
compartimento
apical

(para
el
transporte
apical
a
basal)
y
en
un
volumen
de
1,5
mL
en
el
compartimento

basal
(para
el
transporte
basal
a
apical).
Las
placas
se
incuban
a
37ºC
en
agitación

durante
6
h.
Una
vez
finalizado
el
transporte,
se
toman
alícuotas
de
los
lados
apical

y
basal,
para
su
posterior
análisis
y
cuantificación
por
HPLC
(26).

3.
RESULTADOS
Y
DISCUSIÓN

En
el
presente
trabajo
de
Tesis,
se
ha
evaluado
la
actividad
neuroprotectora

de
seis
diterpenos
andalusol,
conchitriol,
lagascatriol,
foliol,
linearol
y
sidol

aislados
del
género
Sideritis
frente
al
estrés
oxidativo
inducido
por
exposición
a

H2O2
en
los
modelos
celulares
PC12
(modelo
neuronal)
y
U373-­-MG
(modelo
de

astrocitoma).

Para
llevarlo
a
cabo
hemos
establecido,
en
primer
lugar,
las
condiciones
de

daño
oxidativo
para
pasar
posteriormente
a
determinar
si
las
moléculas
en
estudio

protegen
frente
al
mismo.
En
el
estudio
sobre
protección
celular
se
ha
evaluado
el

efecto
sobre
la
viabilidad
celular,
los
cambios
sobre
la
morfología
celular,
el
nivel

de
ROS
intracelular,
los
cambios
sobre
los
marcadores
de
estrés
oxidativo

(peroxidación
lipídica
y
ratio
GSH/GSSG)
y
sobre
la
actividad
y
expresión
de
las

proteínas
de
las
principales
enzimas
antioxidantes
implicadas
en
el
sistema
de

defensa.
El
efecto
de
los
diterpenos
sobre
diferentes
marcadores
de
disfunción

mitocondrial
como
son
los
niveles
de
calcio
citosólico
y
mitocondrial,
el
potencial

de
membrana
mitocondrial
y
los
niveles
de
ATP
también
han
sido
evaluados.
Los

posibles
mecanismos
implicados
en
la
protección
de
los
diterpenos
en
estudio

frente
al
daño
celular
inducido
por
H2O2
han
sido
asimismo
elucidados.

Finalmente,
se
ha
realizado
el
estudio
y
posible
mecanismo
de
paso
de
los

diterpenos
a
través
de
la
BHE.

En
el
presente
resumen
de
Tesis
Doctoral
se
muestra
sólo
una
pequeña

parte
de
los
resultados
obtenidos.

El
H2O2
ha
sido
la
molécula
utilizada
como
agente
generador
de
estrés

oxidativo.
La
formación
de
elevadas
concentraciones
de
H2O2
se
ha
descrito
en
las

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