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E.
M.
González-­-Burgos
&
al.

Línea
celular
ECV304/C6

La
línea
celular
ECV304
corresponde
a
células
endoteliales
de
cordón

umbilical
humano.
Esta
línea
celular
se
obtuvo
de
la
Colección
Europea
de
Cultivos

Celulares
Animales
(ECACC).

La
línea
celular
C6,
procedente
de
células
de
glioma
de
rata,
se
adquirió
de

la
Colección
Europea
de
Cultivos
Celulares
Animales
(ECACC).

En
este
trabajo,
se
emplearon
sistemas
de
cocultivos
entre
las
líneas

celulares
ECV304
y
C6.Estas
células
crecen
en
medio
M199
(Sigma)
suplementado

con
Glutamax
(Sigma-­-Aldrich),
10%
de
suero
fetal
de
ternero
(Gibco,
Invitrogen

Corporation)
y
penicilina/estreptomicina
(100
U/mL;
100
µg/mL)
(Gibco,

Invitrogen
Corporation).
Las
células
se
mantienen
en
atmósfera
húmeda
de
5%

CO2/95%
aire
a
37ºC.

2.3.
Métodos
para
el
estudio
de
estrés
oxidativo
y
disfunción
mitocondrial

En
el
presente
resumen
de
Tesis
Doctoral
se
muestra
una
pequeña
parte
de

los
métodos
empleados
en
el
estudio
de
estrés
oxidativo
y
disfunción
mitocondrial.

-­-
Medida
de
la
generación
intracelular
de
radicales
libres:
Técnica
de

diclorofluoresceína
(DCFH-­-DA)
(19).
Tras
los
tratamientos,
se
añaden
200

µL/pocillo
de
una
mezcla
de
una
solución
de
0,01
mM
DCFH-­-DA
con
PBS
glucosado

(180
mg
glucosa/100
mL
PBS
estéril)
y
se
mantiene
la
placa
en
incubación
durante

30
minutos
a
37ºC.
Después
de
este
tiempo,
las
células
se
lavan
con
200
µL/pocillo

de
PBS
glucosado
y
se
procede
a
la
lectura
utilizando
un
Fluorímetro
Lector
de

microplacas
FLx800,
BioTek,
Instruments,
Inc.,
en
las
condiciones
de
lectura
de

excitación
480
nm
y
de
emisión
510
nm.

-­-
Determinación
de
la
peroxidación
lipídica
(20).
Para
la
cuantificación

de
la
peroxidación
lipídica
se
miden
los
niveles
de
MDA
presentes
en
cada
muestra

mediante
cromatografía
líquida
de
alta
eficacia
(HPLC),
siguiendo
un
protocolo

modificado
de
Grotto
et
al.
(2007).

-­-
Determinación
de
la
actividad
y
expresión
de
enzimas
antioxidantes.

Las
enzimas
estudiadas
han
sido
aquellas
implicadas
en
los
principales
procesos

de
detoxificación
de
ROS:
catalasa
(21),
superóxido
dismutasa
(22),
glutatión

reductasa
(23)
y
glutatión
peroxidasa
(24).
Se
ha
determinado
tanto
la
actividad

por
técnicas
espectofotométricas
así
como
la
expresión
proteica
de
cada
una
de

ellas
mediante
Western
blot.

-­-
Determinación
de
los
niveles
de
calcio
mitocondrial.
La
concentración

de
calcio
mitocondrial
se
determina
midiendo
la
fluorescencia
de
Rhod-­-2.Después

de
los
tratamientos,
las
células
se
lavan
con
medio
de
Krebs
con
calcio
y
sin
sonda

fluorescente,
y
a
continuación
se
incuban
durante
40
minutos
a
37ºC
en
oscuridad

con
medio
de
Krebs
con
calcio
y
con
la
sonda
fluorescente.
Después
de
la

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