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DESCUBRIMIENTO
DE
NUEVOS
ANTIMALÁRICOS
…

mínimo
y
máximo
y
producto)
de
todos
los
?P
se
puede
encontrar
la
mejor

combinación
de
modelos
para
el
cribado
de
grandes
bases
de
datos
(36-­-38).

2.2.
Métodos
in
vitro

El
cultivo
de
Plasmodium
falciparum
fue
mantenido
en
medio
RPMI
1640

suplementado
con
Albumax
(Gibco)
0,5
%,
Hipoxantina
(Sigma)
0,1%
y
glóbulos

rojos
(grupo
O+
o
A+,
2%
hematocrito).
Se
incubaron
a
37°C
y
5%
CO2
(39).

2.2.1.
Microtest
in
vitro
basado
en
florescencia
para
evaluar
actividad

antimalárica

Usando
placas
de
96
pocillos
se
distribuyen
50
µl/pocillo
de
los
productos

previamente
disueltos
en
dimetilsulfóxido
(Panreac),
utilizándose
3
réplicas
por

cada
concentración,
así
como
controles
con
Cloroquina
(CQ)
(Sigma)
y

dimetilsulfóxido
al
0.2
%.
Posteriormente
se
distribuyeron
50
µl/pocillo
del
cultivo

de
Plasmodium
falciparum

de
las
cepas
3D7
y
Dd2,
sensible
y
resistente
a
CQ,

respectivamente,
con
un
hematocrito
del
4
%
y
una
parasitemia
del
1
%,
dejando

controles
de
crecimiento
y
de
glóbulos
rojos
no
parasitados.
Después
de
48
h
de

incubación,
se
añaden
100
µl/pocillo
de
SYBR-­-Green
(Applied
Biosystem)
(0.2

µl/ml)
en
una
solución
de
buffer
de
lisis
y
se
agitan
las
placas
durante
15
min

protegidas
de
la
luz.
Seguidamente
se
mantienen
durante
una
hora
en
reposo
para

favorecer
la
acción
del
agente
intercalante
con
el
DNA
parasitario.

La
lectura
de
la
fluorescencia
se
realiza
en
un
espectrofluorímetro
(Marca

Sunrise
RC
-­-
TECAN)
a
una
longitud
de
onda
de
excitación
de
485nm
y
de
emisión

de
535nm
(40).
El
porcentaje
de
inhibición
(IC)
se
calcula
usando
la
fórmula

siguiente:

%
IC
=
(IF
Control
–IF
Compuesto)
*100

IF
Control

Donde:
IF
=
Intensidad
de
Fluorescencia

2.2.3.
Citotoxicidad
inespecífica
en
macrófagos

Se
mide
la
respiración
celular
como
indicador
de
viabilidad
celular
basado

en
la
reducción
a
nivel
mitocondrial
de
MTT
[bromuro
de
3-­-(4,5-­-dimetiltiazol-­-2-­-
il)-­-2,5-­-difeniltetrazolio]
(Sigma)
(41).
Se
emplearon
macrófagos
de
la
línea
J774

mantenidos
en
frascos
de
cultivo
celular
de
75
cm3,
mediante
pases
sucesivos
en

medio
RPMI-­-1640
suplementado
con
10
%
de
suero
bovino
fetal,
a
37
°C
con
5
%

de
CO2.
Se
despegan
las
células
con
una
solución
de
EDTA/Tripsina
en
Fosfato

buffer
salino
(PBS)
a
1
g/l.
Se
centrifugan
a
1.500
rpm/5
min
y
se
resuspenden
en

medio
fresco
para
determinar
su
concentración
y
viabilidad
a
través
del
recuento

en
cámara
de
Neubauer
con
una
solución
de
azul
tripán
(Sigma).

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