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V. ESTEPA; S. RÓDENAS; M.C. MARTÍN ANAL. REAL ACAD. FARM.

En tubos de ensayo de 10 mL de capacidad, se añaden
respectivamente 100 µL de suero (muestras problema), 100 µL de H2O
destilada (muestra blanco), 100 µL de disolución patrón (muestras patrón)
o 100 µL de disolución control (muestra control) y a continuación los
siguientes reactivos en el orden que se describe:

1) 0,1 mL de reactivo antioxidante

2) 0,1 mL de reactivo catalizador

3) 1,5 mL de disolución tampón

Esta mezcla de reacción se mantiene 60 minutos a 5º C.
Transcurrido este tiempo, se lleva a ebullición en un baño de agua a una
temperatura entre 95º C y 100º C durante 60 minutos, para desarrollar la
máxima coloración en todas las muestras y patrones. Los tubos se tapan
con bolas de cristal como condensadores para evitar pérdidas de líquido
por evaporación.

Una vez verificada la reacción, se procede a la extracción de los
aductos con una disolución mezcla de 2,5 mL de una disolución de n-
butanol-piridina (15:1 V/V) y 0,5 mL de agua destilada (9), enfriando
previamente los tubos en un baño de hielo.

Tras mezclar y centrifugar a 4000 r.p.m. durante 10 minutos, las
capas superiores o sobrenadantes se recogen en un tubo limpio y se
procede a la lectura de las absorbancias a 532 nm, frente a un blanco de
reactivos.

Tanto las muestras de suero, como las disoluciones patrones, control y
blanco de reactivos, se procesan de la misma manera.

La técnica empleada se resume en la tabla siguiente:

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