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teniendo en cuenta todos los antecedentes y la falta de
conocimiento acerca de las bases estructurales que rigen la selecti-
vidad entre ambas enzimas, clave para la obtención de nuevos fár-
macos y mejor comprensión de la función de ambas proteínas a nivel
molecular, se planteó un estudio computacional que permitiese arro-
jar luz sobre el mecanismo. el objetivo de este trabajo ha sido el
estudio de la benzbromarona bb2, descrita por Wiesmann, me-
diante técnicas computacionales de dinámica molecular clásica y cál-
culo de energía libre con el fin de explicar su selectividad y asentar ción, se pasó a la fase de preparación del sistema por pasos: mini-
las bases para el futuro el diseño de inhibidores selectivos hacia
PtP1b.
2. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1. Modelado por homología
Dado que no existen estructuras tridimensionales de inhibi-
dores alostéricos con la hélice a7 resuelta se hizo necesario utilizar librado, liberando las restricciones posicionales gradualmente du-
técnicas de modelado por homología. Para la construcción de los
modelos se emplearon las estructuras depositadas en el Protein Data
bank (PDb) como 1t48 y 1L8K para PtP1b y tcPtP, respectiva-
mente. Para incorporar las estructuras no resueltas de la hélice a7
en ambas proteínas y el loop a6 en 1L8K, se empleó un método
descrito en la bibliografía previamente con el fin de crearlas con el
WPD-loop abierto (27). Junto a estas estructuras se utilizó la PtP1b
completa y con el WPD loop cerrado 2F6F. Del mismo modo, se uti-
lizó el ligando BB2 presente en 1t48 para introducir restricciones
en ambos modelos. Los moldes se alinearon con las secuencias de
la base de datos génica uniprot para ambas enzimas (P18031 para
PtP1b y P17706 para tcPtP) a través de la interfaz gráfica de
usuario del programa modeller 9.2 en ucsF chimera 1.13 (ver ma-
terial complementario) (28) . Los modelos mejor posicionados según
su puntuación en la función Z-DOPe de modeller fueron selecciona-
dos y sometidos a una inspección visual para ajustar aquellos rotá-
metros peor posicionados. el estado de protonación de la proteína
se investigó empleando el servidor H++ (29), a continuación,
tanto el modelo como la red de enlaces de hidrógeno se comprobó
y optimizó con el servidor WHAt-IF (30). tras esto se comprobaron
los mapas de ramachandran con el fin de validar la calidad de los
modelos (ver material complementario).
2.2. Simulaciones de dinámica molecular
Las simulaciones de dinámica molecular se llevaron a cabo
empleando la suite de programas Amber 16 junto con Ambertools
16 (31). La proteína se describió empleando el campo de fuerzas
ff14sb, mientras que para el ligando se utilizó GAFF. Las cargas de
este últimos se asignaron empleando el módulo Antechamber y
ajustándolas a un nivel teórico Am1-bcc. Ambos complejos se sol-
102 Proposal of a computational model for the study of the se-
lectivity of allosteric inhibitors of PTP1B
Javier García Marín
An Real Acad Farm Vol. 86. Nº 2 (2020) · pp. 99 -112
ANALES
RANF
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vataron en un cubo de moléculas de aguas tIP3P de 12 Å de tamaño
de lado y se adicionaron 5 iones de sodio con el fin de neutralizar
el sistema empleando el módulo Leap de Ambertools. A continua-
mización de los hidrógenos, minimización de las moléculas de
disolvente, minimización del sistema completo (aplicando un po-
tencial de restricciones de 5 kcal/mol en los ca de la proteína), ca-
lentamiento hasta los 300 K durante 20 ps con las mismas
restricciones, equilibrado durante 100 ps a 300 K (manteniendo
constante el número de partículas, temperatura y volumen) y equi-
rante 100 ps (manteniendo constante temperatura, volumen y
presión). tras esta última fase de equilibrado, se pasó a la produc-
ción de dos réplicas para cada sistema de dinámica molecular clásica
durante 25 ns, empleando un intervalo de integración de 2 fs. La
producción se llevó a cabo a través de GPus utilizando el módulo
PmemD.cuDA implementado en Amber. Los cálculos requirieron 7
días para completar cada una de las réplicas. todos los sistemas se
simularon por duplicado empleando las condiciones de límite pe-
riódico, y aplicando el método de ewald para tratar las interacciones
electrostáticas de corto alcance con un límite de 8 Å. Así mismo, se
empleó el algoritmo sHAKe (32) en todos los enlaces en los que
participan átomos de hidrogeno con el fin de simplificar los cálculos
durante la dinámica. Las trayectorias de la dinámica molecular se
analizaron empleando el software cpptraj, VmD y chimera.
2.3. Cálculos con WaterSwap
Para el cálculo de la energía libre se empleó el programa ba-
sado en el método de montecarlo, Waterswap (33). Las estructuras
empleadas para llevar a cabo estos cálculos procedían de los 15 ns
de dinámica cuando el sistema se encontraba en equilibrio termo-
dinámico. Los cálculos se llevaron a cabo en el módulo implemen-
tado en el paquete de programas sire, utilizando los mismos datos
de topología y parámetros generados para la dinámica molecular
(Amber ff14sb). La energía libre de unión absoluta se calculó me-
diante el método de integración termodinámica de réplica de inter-
cambio, a lo largo de 16 ventanas de transformación
ligando-moléculas de agua. todos los cálculos requirieron de 7 días
para ser completados. Las energías finales se obtuvieron utilizando
el script de Python freenrg, también presente en la suite sire.
3. DISCUSIÓN Y RESULTADOS
3.1. Modelado por homología
Para llevar a cabo el estudio con la benzbromarona BB2, se
hizo necesario el uso de técnicas de modelado por homología que
permitiesen predecir las estructuras tridimensionales de ambas en-