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ANALESRANFwww.analesranf.comforma espec%u00edfica en la secuencia FASTA de losgenes diana y se valid%u00f3 su secuencia con BeaconDesigner.3.2.4.b Preparaci%u00f3n de la curva decalibradoLa utilizaci%u00f3n de la t%u00e9cnica de PCR a tiempo realpara la cuantificaci%u00f3n y estudio de la expresi%u00f3ng%u00e9nica precisa de la realizaci%u00f3n de una recta decalibrado para poder relacionar los valores de lase%u00f1al de amplificaci%u00f3n resultantes obtenidos en lasmuestras con la cantidad de ADN de las mismas.Tambi%u00e9n se calcul%u00f3 la eficiencia de las parejas deprimers (E) utilizando los Cp de las rectas decalibrado realizadas.Las rectas de calibrado se realizaron para cadapareja de cebadores preparando dilucionesseriadas 1:10 del ADNc de partida y obteniendo lasconcentraciones finales de 50, 5, 0.5 y 0.05 ng/mLPor %u00faltimo, para verificar que los cebadoresamplificaban el producto esperado y no seamplificaban productos no deseados, se llev%u00f3 acabo una curva de melting y una electroforesis endel de agarosa al 1% (p/v) (Figura A3 del anexo).3.2.4.c Protocolo PCR a tiempo real parala cuantificaci%u00f3n de la expresi%u00f3n g%u00e9nicaSe analizaron las muestras de ADNc obtenido apartir de h%u00edgado e %u00edleon con los cebadoresmencionados anteriormente en un TermocicladorCFX96 Touch Real-Time PCR Detection System(BioRad, EEUU). En el protocolo de amplificaci%u00f3nse llev%u00f3 a cabo con un volumen total de 20mL pormuestra y por duplicado. Para cuantificar laexpresi%u00f3n g%u00e9nica se utiliz%u00f3 el m%u00e9todo de Pfaffl,tambi%u00e9n conocido como el m%u00e9todo 2- Ct (35).Para cada muestra, los vol%u00famenes de reactivosa%u00f1adidos fueron: 6mL de agua mili-Q est%u00e9ril, 1mLde cebador F (10mM), 1mL de cebador R (10mM),2mL de muestra de ADNc y 10mL de SyBR GreenPremix Ex Taq (Takara Bio Inc., Jap%u00f3n).En cuanto al ADNc, para garantizar que losvalores de Cp obtenidos tras la PCR se pudieseninterpolar en la recta de calibrado, laconcentraci%u00f3n utilizada fue de 5ng/mL, obtenidaa partir de una diluci%u00f3n 1/30 del ADNc de partidaen las muestras procedentes de h%u00edgado e %u00edleon.Adem%u00e1s, con esto se aseguraba que los valores deCp se mantuvieran por debajo de los 33 ciclos, apartir de los cuales aumenta el riesgo de obteneramplificaciones inespec%u00edficas y disminuye laeficiencia.(desoxirribonucleasas) que degradan el ADNpresente en la muestra. A continuaci%u00f3n, sedetermin%u00f3 de nuevo la concentraci%u00f3n de ARN,siguiendo el protocolo mencionado anteriormente.Por %u00faltimo, se realiz%u00f3 una reacci%u00f3n en cadena dela polimerasa (PCR) para comprobar la ausencia deADN contaminante en las muestras utilizando loscebadores de RPS29 (prote%u00edna ribosomal S29), genutilizado como gen de referencia. Tal y como seesperaba, no se observaron bandas de ADN en lasmuestras de ARN tratadas con DNasa.3.2.3. Retrotranscripci%u00f3nPara cuantificar la expresi%u00f3n g%u00e9nica o cantidadde ARNm de las muestras, es necesario convertirpreviamente el ARNm en ADN complementario(cDNA). As%u00ed, se realiz%u00f3 una retrotranscripci%u00f3n(reacci%u00f3n en cadena de la polimerasa transcriptasainversa, RT-PCR) con el kit SuperScript%u00ae II ReverseTranscriptase (Invitrogen, EEUU) y el TermocicladoriCycler (BioRad, EEUU), para la cual se utilizaron2,5 ng de ARN tratado con DNasa de muestras deh%u00edgado e %u00edleon.Tras la retrotranscripci%u00f3n se llev%u00f3 a cabo unaPCR convencional (a punto final) con cebadoresespec%u00edficos del gen RPS29 y una electroforesis engel de agarosa para asegurar que el ADNc obtenidoera funcional obteni%u00e9ndose el producto deamplificaci%u00f3n del gen de referencia (Figura A2 delanexo).3.2.4. Estudio de la expresi%u00f3n g%u00e9nicaLa qPCR o PCR a tiempo real es una t%u00e9cnica quecombina la amplificaci%u00f3n y la detecci%u00f3n en unmismo paso, ya que correlaciona el producto de laPCR de cada ciclo con una se%u00f1al fluorescente, lacual aumenta de manera proporcional seg%u00fanavanzan los ciclos y el producto se amplifica. Paraello es necesario el empleo de un fluor%u00f3foro, queen nuestro caso fue SyBR-Green I, el cual trasasociarse al ADN de doble cadena emite una se%u00f1alfluorescente (34).3.2.4.a Dise%u00f1o de primersLa informaci%u00f3n sobre los primers empleados enel presente estudio se muestran en la Tabla A1 delanexo. Se utiliz%u00f3 Primer Blast para dise%u00f1ar lasparejas de cebadores en las siguientescondiciones: temperatura de melting (Tm) de 60%u00baCy de 100 a 300 pb de producto de amplificaci%u00f3n.Se confirm%u00f3 que los cebadores amplificaban deEfectosnutrigen%u00f3micosdelafructosasolaoasociadaacolesterolosalenlafunci%u00f3ndelashormonastiroideas.InfluenciadelaingestamaternaCarlaMarcuccini,ElenaFausteetal. 183 An. R.Acad. Farm.Vol. 90. n%u00ba 2 (2024) %u00b7 pp. 175-196