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Alemania) en secciones de 5 µm, las cuales fueron fijadas Juan de Toro Martín et al.
sobre portaobjetos con calor (37º C). Los cortes fueron
posteriormente desparafinados en xileno y rehidratados glucosa plasmática (mmol/l) × insulina plasmática
con alcoholes de graduación decreciente y agua destilada (µU/ml)/22.5.
para llevar a cabo los marcajes histoquímicos e
inmunohistoquímicos correspondientes. 2.5. Antagonismo farmacológico de GIP in vivo
El tamaño de los adipocitos y la presencia de lípidos en Con el objetivo de determinar el papel de GIP en el
muestras hepáticas de manera indirecta, se determinó desarrollo de un fenotipo obeso-diabético en las hembras
mediante una tinción de hematoxilina/eosina. Para ello, los de la población subnutrida y posteriormente realimentada
cortes histológicos fueron incubados con hematoxilina de con dieta grasa (SR), las ratas fueron inyectadas i.p. (25
Harris (Accustain Harris Hematoxylin, Sigma-Aldrich) y nmol/kg) con un antagonista de GIP (Pro3(GIP), Europe
eosina (Eosina Amarillenta 1% DC, Panreac, Castellar del GmbH, Karlsruhe, Alemania) durante los últimos 21 días
Vallés, España) durante un tiempo variable (1-2 min) y, en dieta. Para llevar a cabo este estudio, un grupo de
finalmente, lavados con etanol 70º y agua destilada. hembras SR fue inyectado diariamente (17:00 p. m.) con
Pro3(GIP), mientras que a otro grupo se le administró un
La detección inmunohistoquímica de GIP se llevó a vehículo salino (NaCl 0.9% p/v). La dosis administrada
cabo en muestras tisulares de duodeno, donde la presencia fue seleccionada en función de estudios previos (22,23).
de células K, productoras y secretoras de GIP, es más
abundante y homogénea. Para ello, se utilizó una técnica 2.6. Análisis estadísticos
combinada de biotina-avidina (Vectastain Elite ABC kit,
Vector). Los cortes histológicos fueron incubados con Los resultados fueron expresados como la media
anticuerpos primarios frente GIP (24 h, 4 ºC) y, tras varios aritmética de los datos y su error estándar. La significación
lavados con TBS, se incubaron con anticuerpos estadística fue analizada mediante la prueba t de Student,
secundarios especie-específicos acoplados a biotina (1 h, para comparaciones de dos grupos, y mediante la prueba
temperatura ambiente). Finalmente, las muestras se ANOVA, para comparaciones de más de dos grupos. Los
pusieron en contacto con una solución de avidina acoplada coeficientes de correlación de Pearson fueron calculados
a peroxidasa (30 min, temperatura ambiente). El número para determinar interrelaciones entre variables. La
de células positivas para GIP fue analizado mediante significación fue considerada siempre que P<0.05. Los
recuento directo y los resultados se expresaron como resultados fueron analizados con el software GraphPad
número de células por unidad de área de epitelio. Las Prism 6 (San Diego, EEUU).
micrografías fueron realizadas con un microscopio óptico
(Eclipse 80i, Nikon, Tokyo, Japan) acoplado a una cámara 3. RESULTADOS
digital (XCD-U100CR, Sony, Tokyo, Japan) y fueron
analizadas con el software informático Histolab 3.1. Las ratas SR experimentaron hiperfagia, incremento
(Microvision Instruments, Evry, Francia). de la adiposidad e hipertrigliceridemia
2.4. Test de tolerancia oral a la glucosa Tras el destete, independientemente del sexo o del
estatus nutricional previo, todas las ratas ganaron peso
Los test de tolerancia oral a la glucosa (OGTT) se cuando fueron alimentadas con dieta grasa. Sin embargo,
llevaron a cabo tras la finalización de las 22 semanas de tras 22 semanas en dieta, el peso de las ratas SR no fue
dieta. Para ello, tras 16 horas de ayuno, las ratas recibieron superior al mostrado por la población CR (Figura 2a,d).
una dosis oral de glucosa (40% p/v, 2 g/kg) y se recogieron
muestras plasmáticas de la cola de los animales a Tanto los machos como las hembras S mostraron un
diferentes tiempos (0, 10, 30, 60, 90 y 120 min). Con el fin menor peso corporal respecto a la población C durante
de evitar la degradación de GIP, las muestras se recogieron todo el desarrollo de los experimentos (Figura 2a,d), así
en tubos con un inhibidor de la enzima dipeptidil como de la ingesta alimentaria (Figura 2b,e) y calórica
peptidasa-IV (10 µl/ml; DPP-IV inhibitor, Millipore). La (Figura 2c,f). Aunque la cantidad de alimento ingerido por
determinación de la concentración de insulina y GIP total las ratas SR fue significativamente menor, en comparación
se llevó a cabo mediante multiplex y la glucemia fue con la población CR (Figura 2b,e), éstas fueron
determinada en los tiempos anteriormente descritos con un significativamente hiperfágicas cuando la cantidad de
glucómetro (OneTouch Ultra 2, LifeScan, Milpitas, alimento ingerido se corrigió por el peso corporal (Figura
EEUU). El área bajo la curva (AUC) de glucosa fue 2c,f).
calculada aplicando la regla trapezoidal sobre los niveles
de glucemia durante 120 minutos tras la sobrecarga oral de La proporción de grasa visceral mostrada por las ratas
glucosa. El índice de resistencia a la insulina (HOMA-IR) S fue significativamente inferior al de las ratas C (Tabla 2)
fue calculado con la siguiente fórmula: HOMA-IR= y, de manera más acusada, en las hembras que en los
machos (hembras: 4.7 vs machos: 2.2 veces). Sin embargo,
tras la alimentación con dieta grasa, los depósitos de grasa
visceral mostraron un aumento significativo en las ratas
CR y SR, independientemente del sexo (Tabla 2).
188 @Real Academia Nacional de Farmacia. Spain
