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la porción de muestra? ¿Podríamos añadir una cantidad J. Cuadrado, C. Cuadrado, B. Cuadrado
mayor o menor de diluyente, con la posibilidad de abaratar
costes y procesar mayor número de muestras en el menor -Caldo de enriquecimiento Muller-Kauffmann
tiempo posible? tetrationato-novobiocina y Rappaport-Vassiliadis con soja.
¿Cuántas unidades formadoras de colonias (ufc) -Medio de aislamiento selectivo diferencial, XLD y
teóricas de la bacteria diana detectaríamos en el otro apropiado para aislar Salmonella spp.
aislamiento final en placa? ¿Disminuye la eficacia
detectora de patógenos en alimentos mediante la técnica -Sistema de identificación bioquímica y antisueros
por PCR, si no se realiza enriquecimiento de la muestra? específicos.
¿Disminuye igualmente la detección si se realiza
enriquecimiento según indican los procedimientos de 2.3. Planteamiento
investigación tradicionales en base a normas
internacionales de estandarización? ¿Disminuye En las normas internacionales de estandarización (6) se
igualmente la detección si se realiza enriquecimiento con contempla la posibilidad de enriquecer la muestra en un
alguna modificación en cuanto a dilución, tiempo de medio nutritivo para favorecer el crecimiento de los
incubación para las determinaciones de investigación? microorganismos diana. Es frecuente el enriquecimiento
Partiendo de un alimento, como puede ser una muestra de con caldo a la temperatura adecuada a cada
carne fresca de porcino de 25 g, consideramos que si ésta, microorganismo, durante 24 horas (7,8,9,10,11,12) en los
tuviese una bacteria de Salmonella en esos 25 g, con la ensayos de PCR para detectar bacterias patógenas en los
posible flora acompañante, los nutrientes de la muestra, alimentos. Realizar enriquecimientos 24 horas a 30, 35, 37
serían suficientes para la reproducción de los ºC según métodos tradicionales de investigación por la
microorganismos presentes, sin embargo, en caso de que la International Organitation for Standards (ISO) para
flora acompañante competitiva existiese de manera sobre realizar ensayos mediante PCR conlleva:
abundante, podría llevarnos a pensar que su supervivencia
estaría comprometida, por lo cual, añadimos nutrientes en Un día más en la finalización del análisis.
abundancia y condiciones favorables para su reproducción, 225 ml de caldo por muestra.
¿cuáles? En la fase de enriquecimiento para la Procesamiento de 10 a 20 bolsas de stomacher como
determinación de Salmonella spp se adiciona máximo (250 ml por muestra) por estufa de cultivo (de
habitualmente, agua de peptona tamponada que aporta unos 50 litros de capacidad).
además de proteínas, cloruro de sodio, hidrógeno fosfato Necesidad de cinco o más estufas de 50 litros, para
disódico dodecahidratado y dihidrógeno fosfato de potasio. obtener un 100% de rendimiento en los ensayo de PCR, ya
Esta etapa se da a temperatura óptima 37 ± 1 ºC y tiempo que estos pueden procesar noventa y seis muestras por
adecuado de 16 a 20 horas (3). Los cálculos realizados análisis(13).
para obtener la concentración bacteriana (tabla 2) parten -No es obligatorio pero sí adecuado enriquecer la
del tiempo de generación para Salmonella typhimurium en muestra (5).
un medio con aminoácidos y sales (agua de peptona -Si se disminuyese el volumen de solvente, se podrían
tamponada), considerando así la tasa de crecimiento de procesar más muestras en menos tiempo y con menos
Salmonella de 20-30 minutos (4,5). requerimientos físicos (reactivos, materiales, equipos,
tiempo, personal).
2. MATERIAL Y MÉTODOS -La preparación de noventa y seis muestras para la
PCR (14,13) y el análisis mediante esta técnica conlleva no
2.1. Material y aparatos más de dos horas y treinta minutos (15).
-Balanza o delta dilutor. 2.4. Experimento
-Probetas de vidrio de 100-250 mL.
-Pipetas estériles de 1 mL. Con estos acontecimientos, se realiza un experimento
-Homogeinizador (stomacher). consistente en ver si la carga de microorganismos diana es
-Asas de cultivo estériles. mayor de 103 /ml de una solución cuyo volumen no sea
-Mechero de gas. superior a 100 ml e inferior a 50 ml y en la que esté
-Bolsas de stomacher estériles con filtro y soporte para presente el alimento a razón de 25 g, homogeneizado y
incubar. disuelto en caldo de enriquecimiento apropiado, no
-Tijeras, pinzas, bisturí, hojas, cucharilla u otro superando los volúmenes indicados. Se utilizan dos
material similar para manipular las muestras. matrices, una sólida y otra líquida, se realiza un ensayo
-Estufas de cultivo calibradas a las temperaturas de para cada matriz con el fin de ver que la muestra natural no
incubación que corresponda. tenga contaminación del patógeno diana, se realizan en
ambas matrices ensayos repetidos a distintas diluciones y
2.2. Reactivos y medios de cultivo contaminando la muestra con lentículas de la national
collection of types culteres (NCTC) certificadas y a la
-Agua de peptona tamponada. concentración más baja posible detectada en el laboratorio.
10 2.5. Procedimiento operativo de análisis
Realizar cada uno de los ensayos como se relacionan
siguiendo la ISO 6579:2003 (ver Tabla 1).
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