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ANALES - ATR
RANF La presencia de ácido fólico en la superficie de las nano-
partículas se confirmó mediante espectroscopia infrarroja utilizando
www.analesranf.com la técnica de Atr (Attenuated total reflection) mediante el espec-
tofotómetro Nicolet-magna-750 equipado con spectra-tech H-Atr
metano), se goteó sobre una solución acuosa de PVA y se sonicó (LabX, usA) en un rango de 4000 a 400 cm-1.
(Fisher scientific-sonicator,usA). La suspensión resultante se man- - Estudios de liberaciónin vitro del CBD
tuvo en agitación (500 rpm) durante 3 horas a temperatura am- Las nanopartículas de cbD liofilizadas se suspendieron (5
biente para evaporar el diclorometano. Las nanopartículas se mg/ml) en Pbs (pH=7.4 +tween-80 0.5 % (p/v)) y se introduje-
recolectaron por centrifugación (15000 rpm durante 35 minutos) ron en un baño termostatizado a 37±0.5 ºcon una agitación cons-
(beckman-coulter-Avanti, usA), se lavaron tres veces con agua des- tante de 100 rpm. A distintos tiempos, se extrajeron alícuotas, se
mineralizada para eliminar el exceso de PVA y se liofilizaron du- centrifugaron, filtraron y analizaron por HPLc.
rante 24 horas a -50 ºc y 0.2 mbar. como crioprotector se añadió 2.5.4. Estudios en cultivos celulares
1 ml de una solución de sacarosa al 3 % (p/v). Para la optimización - Eficacia antitumoral in vitro
del protocolo de elaboración de la formulación se emplearon dife- La citotoxidad de las formulaciones de cbD en un rango
rentes porcentajes de cbD (1,5-3 %); diferentes porcentajes de PVA de concentraciones de cbD de 5-50 µm, se evaluó en las células
(1 y 3 %) y diferentes tiempos de sonicación (2-5). sKOV-3 siguiendo el protocolo descrito en el apartado 2.3.1.
- Estudios de internalización:
2.5.2.Funcionalización de las nanopartículas de CBD La captación de las nanopartículas no funcionalizadas y
el ácido fólico se incorporó a la superficie de las nanopar- funcionalizadas con ácido fólico se evaluó por microscopía de fluo-
rescencia empleando las nanopartículas cargadas con DiO. Las cé-
tículasno liofilizadas y recién preparadas. en primer lugar, se acti- lulas sKOV-3 se sembraron, a una densidad de 30000 células/pocillo
varon los grupos cOOH libres de la superficie de las nanopartículas en placas Ibidi de 8 pocillos. 12 horas más tarde se trataron con una
mediante la adición de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodii- concentración de nanopartículas de 1 mg/ml y se incubaron a 37 ºc
mida y N-hidroxisuccinimida( pH de 4.7). La suspensión se mantuvo y un 5 % cO2 durante 0.5, 1, 2, 4, 6 y 8 horas. A cada tiempo, las
en agitación durante 2 horas. Las nanopartículas se recolectaron células se lavaron con Pbs, fijaron con paraformaldehído 4 % (p/v),
por centrifugación, se re-suspendieron en Pbs (pH 7.4, 9 ml) que tiñeron con DAPI y red-Phalloidin y se observaron por microscopía
contenía 6 mg de ácido fólico y se mantuvieron en agitación 4 horas. de fluorescencia (eVOs™, Fisher-scientific, usA).
Finalmente, las formulaciones funcionalizadas se recolectaron y lio- 2.5.5. Actividad antitumoral in vivo de las nanopartículas
filizaron. de CBD
La actividad antitumoral en monoterapia de las nanopar-
2.5.3. Caracterización de las nanopartículas de CBD no tículasde cbD también se evaluó en tumores derivados de las células
funcionalizadas y funcionalizadas con ácido fólico sKOV-3 generados sobre la mcA de embriones de pollo, tal y como
describimos en el apartado 2.4.1. en el DDe=11 los tumores se tra-
Las nanopartículas se caracterizaron determinando: taron diariamente (hasta el DDe=13.5) con las diferentes formula-
- Tamaño de partícula, índice de polidispersión y potencial ciones de cbD: i) cbDsol,ii) cbD-Nps y iii) FA-cbD-Nps a una
zeta: concentración de cbD de 100µm. Las formulaciones de nanopartículas
se determinaron por dispersión dinámica de luz láser mi- blancas (PLGA-Nps y FA-PLGA-Nps) también se evaluaron.
crotrac®-Zetatrac™ Particle-Analyzer (microtrac, usA). 2.5.6. Estudios de combinación con PTX
- Morfología se determinó el efecto antitumoral in vitro de las nanopar-
Las nanopartículas se suspendieron en agua purificada y tículas de cbD, no funcionalizadas y funcionalizadas con ácido fólico
añadieron sobre una oblea de silicio adherida a un soporte metálico. en combinación con el paclitaxel (10-500 nm) en las células sKOV-3
se secaron a vacío, se metalizaron con una capa de 20 nm de oro y siguiendo el protocolo de pre + coadministración recogido en el apar-
se observaron al microscopio electrónico de barrido (Jeol-Jsm-6335F, tado 2.3.5.
Japón).
- Determinación del contenido en CBD y eficacia de en-
capsulación.
Las nanopartículas liofilizadas se disolvieron en dicloro-
metano (5 mg/ml). el cbD se extrajo con la adición de fase móvil
de HPLc en agitación. Las muestras se filtraron y analizaron por
HPLc (33). La eficacia de encapsulación se calculó mediante la si-
guiente ecuación:
ratio cbD:PLGA experimental
ee (%)= ratio cbD:PLGA teórico) *100
Quimioterapia nanométrica a base de cannabinoides 137
para el tratamiento de tumores ginecológicos
Ana I. Fraguas , Ana I. Torres Suárez, et al
An Real Acad Farm Vol. 86. Nº 2 (2020) · pp. 133-150
