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2.3.4. Ensayos de invasión celular
el efecto del cbDsol en la invasión de las células sKOV-3
se determinó mediante el ensayo tipo transwell. Los insertos trans-
well (8 µm de tamaño de poro) de placas de 24 pocillos (Falcon,
usA) fueron previamente cubiertos con una solución de Geltrex
(150µL/cm2). Las células sKOV-3 se añadieron a la cámara superior
del inserto en medio de cultivo libre de suero bovino. en la cámara
inferior se añadió medio de cultivo con suero al 10 % como qui-
mioatrayente. el cbDsol (15 and 30µm) se añadió en ambas cá-
maras. Después de 24 horas, los insertos se lavaron cuidadosamente
con Pbs y las células remanentes en la cámara superior se elimina-
ron con una torunda de algodón. A continuación, las células pre-
sentes en la cámara inferior del inserto (células que han invadido)
se fijaron, tiñeron y cuantificaron siguiendo el protocolo descrito en
el apartado 2.3.3 para el ensayo de migración transwell.
Los resultados obtenidos se corrigieron con los datos de
viabilidad celular. el porcentaje de invasión también se calculó y ex- medad relativa, bajo rotación automática(180 ºc / 4 horas). el
presó de manera relativa con respecto al control (100 %).
2.3.5. Estudios de combinación con otros antineoplási-
cos:
- Estudios de sensibilización (preadministración):
el objetivo es evaluar si la administración previa de con-
centraciones subterapéuticas de cbD (muerte celular <10 %) in-
crementa la sensibilidad de las células tumorales de ovario al PtX,
DOX y cIs. Las células sKOV-3 se sembraron en placas de 96 pocillos
(1.5 104 células/cm2) y se trataron, 24 horas después, con cbDsol
(1 y 10 µm). A continuación, las células se trataron exclusivamente
con PtX (10-500 nm), DOX (0.5-60 µm) y cIs (1-100 µm). tras 48
horas de incubación se determinó la viabilidad celular mediante
mtt y se calcularon los valores de cI50 . se consideró que se producía tamiento ]DDe:11*100/ [Área del tumor tras el tratamiento]
un efecto sensibilizador si había una disminución estadísticamente
significativa en los valores de cI50 en las células pretratadas con
cbD.
- Estudios de sinergismo (coadministración):
Las células sKOV-3 se sembraron en placas de 96 pocillos
(1.5 104 células / cm2) y se trataron, 24 horas después, con las dife- o medio rPmI-1640 durante 24 horas. A continuación, en el
rentes combinaciones de cbD en solución (10, 15 y 20 µm) y PtX
(10-500 nm), DOX (0.5-60 µm) o cIs (1-100 µm). tras 48 horas, la
viabilidad celular se determinó mediante mtt. se calcularon los va-
lores de cI50 y los Ic utilizando el software compusyn (30). Ic >1
indican antagonismo, Ic= 1 efecto aditivo y Ic<1 sinergismo(31).
también se determinó el efecto de la combinación de cbD
y PtX en la inducción de apoptosis. Las células sKOV-3 se trataron
con PtX (100 nm) o PtX (100 nm)+ cbD 20 µm durante 48 horas.
La apoptosis se determinó por citometría de flujo siguiendo el pro-
tocolo descrito en el apartado 2.3.2.
Cannabinoid based chemo-nanotherapy for the treat-
136 ment of gynecological malignancies
Ana I. Fraguas , Ana I. Torres Suárez, et al
An Real Acad Farm Vol. 86. Nº 2 (2020) · pp. 133-150
ANALES
RANF
www.analesranf.com
- Pre + coadministración:
Las células sKOV-3 se sembraron en placas de 96 pocillos
(1.5 104 células / cm2) y se trataron, 24 horas después, con cbDsol
(10 µm) durante 24 horas. A continuación, el medio se descartó, y
las células se trataron con las combinaciones de cbD (10µm) +
PtX (10-500 nm) durante 48 horas. La viabilidad celular se deter-
minó por mtt y se calcularon los valores de cI50.
2.4.Actividad antitumoral in vivo del CBD en solución
2.4.1. Actividad del CBDsol en monoterapia
La actividad anticancerígena del cbDsol también se ter-
minó in vivo, usando el modelo " in ovo", en el que los tumores se
generan sobre la mcA de embriones de pollo (32). Los huevos de
gallina fecundados (DDe=0) se incubaron a 37 °c y 47 % de hu-
DDe=4, se realiza un pequeño orificio (3 mm) en la cáscara del
huevo, se tapa con cinta adhesiva y se introducen de nuevo en el in-
cubador sin rotación. el DDe=8, el orificio se agranda y la mcA se
“araña” suavemente sin comprometer la viabilidad del embrión. A
continuación se inoculan las células sKOV-3 (2•106 cells/huevo) sus-
pendidas en una solución de Geltrex®. el DDe=11, los tumores
ya formados, se rodean con un anillo de silicona y se tratan con:
cbDsol diariamente (100 µm) y medio de cultivo rmPI 1640 que
sirve como control. Al menos se trataron 7 huevos por condición. Los
huevos se mantuvieron en el incubador hasta el DDe=13.5. el cre-
cimiento del tumor se monitorizó por microscopía (Lumenera INFI-
NItY2-1 cDD), calculando el área de los tumores antes y después
del tratamiento, utilizando la siguiente ecuación:
crecimiento tumoral (%)=[Área del tumor antes del tra-
DDe:13.5
2.4.2. Actividad del CBDsol en combinación con PTX
La combinación del cbD y PtX también se ha evaluado
en este modelo, utilizando el protocolo de pre + coadministración.
el DDe=11, los tumores se trataroncon cbD en solución (100 µm)
DDe=12 se administró el PtX (100µm). el cbD en solución se
añade diariamente hasta el DDe=13.5. Al menos se trataron 7
huevos por condición. el crecimiento del tumor se monitorizó tal y
como describimos en el apartado anterior (2.4.1).
2.5. Desarrollo de las nanopartículas de CBD
2.5.1. Elaboración de las nanopartículas de CBD
se empleó el métodode evaporación-extracción del sol-
vente. La fase orgánica (PLGA+ cbD disueltos en 1 ml de dicloro-