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aunque en SOD2 si se formaban puentes disulfuro
intracatenarios (41).
La hidrólisis total con HCl fue empleada para el
análisis de la composición aminoacídica de la SOD1 y la
SOD2, donde además se empleó para la SOD1, el
tratamiento con dimetilsulfóxido y la oxidación con ácido
perfórmico, para identificar las cisteínas presentes en dicha
isoforma. La identificación de grupos sulfidrilos por
subunidad, fue realizada con p-cloromercurifenil sulfonato
y arrojó como resultado 1,2 grupos por subunidad, lo que
se reducía a 0,3 grupos en la enzima autoxidada y
mantenida en una solución de fosfato de potasio a 0,05 M
y EDTA, pH=7,8 por 2 semanas. Este resultado indica que
la autoxidación de la SOD1 disminuye su reactividad, en
términos de grupos sulfidrilos accesibles a un modificador
químico (41).
Por otra parte, han sido evaluados algunos factores que
influyen sobre la catálisis de la SOD1 de eritrocitos
bovinos, tales como la oxidación (42). La inhibición de la
SOD1 por su producto, H2O2, fue examinada en términos
de la oxidación de la histidina 118, ubicada en el centro
catalítico, lo que redujo significativamente la actividad. El
residuo oxidado en forma de 2-oxo-histidina, pudo ser
detectado por hidrólisis ácida y análisis de la composición
aminoacídica de la SOD1 por RP-HPLC, que después se
identificó en la posición 118 por mapeo tríptico y análisis
peptídico por RP-HPLC. El estudio de modificación
selectiva de histidina con H2O2, demostró la importancia
de este residuo en el mecanismo catalítico de la enzima y
su implicación en la inactivación por producto.
Una de las mayores aplicaciones de la modificación
química en la SOD, constituye el mejoramiento de la
enzima para su uso terapéutico, que se propone extender el
tiempo de vida media en sangre, minimizar la inactivación
y mejorar la estabilidad en condiciones fisiológicas.
Sobre este tema tratan los trabajos de Veronese F. et al. actividad por 3 horas, lo que indica que la modificación no
en 1985 (43), que describen un método factible para la
obtención de conjugados de monometoxi-polietilen glicol
con proteínas y péptidos, empleando derivados
fenilcarbonados de polietilen glicol (PEG). Estos
derivados altamente reactivos, pueden lograrse mediante
reacción con 2,4,5-tricloro-fenilcloroformiato o p-
nitrofenilcloroformiato.
Empleando dicho procedimiento, obtienen un derivado
SOD1-PEG que posee mayor tiempo de retención en
sangre en ratas a las cuales les fue administrado por vía
endovenosa, respecto a la SOD1 nativa, la cual es aclarada
rápidamente por los riñones y detectada en la orina de los
animales. La conjugación con polímeros aumenta el radio
de la molécula, lo que disminuye su aclaramiento por
filtración en el glomérulo renal y además preserva frente a
la acción de proteasas (43).
La enzima modificada es menos inmunogénica y es
reconocida con baja afinidad por anticuerpos específicos,
debido a que el PEG modifica múltiples grupos amino en
la proteína, por lo que logra bloquear epítopos que afectan
el reconocimiento. Esto puede constituir una ventaja si se
desea administrar enzimas no humanizadas o en forma
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Mario Riera Romo
quimérica directamente en la sangre, con poco rechazo
inmunológico. También se evaluó la actividad del
derivado, la cual no varió significativamente del control no
modificado, evidenciando que la conjugación no afecta los
residuos del centro activo ni la conformación nativa (43).
La modificación con PEG o pegilación como
herramienta para mejorar las propiedades de las isoformas
de la SOD, ha sido también aplicada en la optimización de
una terapia experimental en modelos de rata para la
Isquemia Cerebral (44). La inyección intravenosa de
10,000 U/kg de PEG-SOD disminuye el volumen de
infarto a 139 +/- 9 mm3, respecto a un control tratado con
placebo, en el cual fue de 182 +/- 8 mm3, resultados que
fueron determinados para un total de 38 individuos.
Estos resultados confirman el efecto protector y de
estabilidad conferido al PEG, y constituyen más hallazgos
que relacionan la SOD con enfermedades inflamatorias y
lesiones tisulares.
Un enfoque interesante sobre la misma aplicación, es
planteado por Fujita T. et al. en 1992 (45), donde exponen
cómo es posible mejorar la estabilidad en plasma de la
SOD humana recombinante (hSODr) y dirigir su acción a
tejidos específicos, empleando la conjugación con
polisacáridos y monosacáridos. Mediante la síntesis de
cuatro derivados diferentes, hSOD-carboximetil dextrano,
hSOD-dietilaminoetil dextrano, hSOD galactosilada y
hSOD manosilada, evaluaron el tiempo de vida en plasma
y la distribución de los productos modificados por
farmacocinética en modelo de ratón, así como la actividad
de los conjugados.
Los derivados obtenidos retuvieron de un 50 a un 80 %
de la actividad enzimática original y fueron estables en una
incubación con suero de ratón, manteniendo un 80 % de la
afecta la actividad y los conjugados no son neutralizados
por anticuerpos murinos. La administración por vía
intravenosa de la hSODr nativa conllevó a una rápida
eliminación por vía renal, siendo detectada en alta
concentración en la orina, mientras la hSOD-carboximetil
dextrano presentó un elevado tiempo de vida media en
plasma, debido a la no filtración glomerular y a la
interacción con los tejidos. Las formas galactosilada y
manosilada de la hSOD fueron incorporadas en poco
tiempo a las células parenquimatosas y no
parenquimatosas del hígado, por endocitosis mediada por
receptor. La cinética de este aclaramiento hepático
presentó un comportamiento no lineal, disminuyendo con
incrementos en la dosis, con un valor máximo a la dosis
mínima de 0.1 mg/kg (45).
Por otra parte, la hSOD-dietilaminoetil dextrano se
acumuló rápidamente en hígado, pero esta retención fue de
tipo electróstático y constituye un mecanismo de captación
menos específico (45).
En conjunto, estos resultados validan la modificación
con compuestos mono y polisacarídicos, no sólo en el
mejoramiento de la estabilidad y el tiempo de vida media
en plasma de la hSODr, sino en su biodistribución. Esta
aplicación aporta ventajas claras para las terapias basadas
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