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histidina, respectivamente. El quinto mutante, H143, sólo
presentaba una histidina en lugar de la glutamina 143.
La variante salvaje, que contiene glutamina en la
posición 143, y los mutantes, no presentaron diferencias en
sus patrones electroforéticos, sus perfiles cromatográficos
en condiciones desnaturalizantes, ni en los análisis
realizados por espectrometría de masas.
Sin embargo, la actividad específica fue mayor para la
enzima nativa, mientras el mutante H143 tuvo la menor
actividad, que representó el 16 % de la determinada para la
variante salvaje. Los mutantes simples Y34F-Q y S82A-Q
retuvieron un 67 y un 81 % de la actividad y los dobles
mutantes Y34F-H y S82A-H, presentaron un nivel de
actividad específica similar a H143. Estos resultados
sugieren que este residuo de glutamina es importante para
la catálisis, al parecer para la fijación o estabilización de
algún intermediario formado, pues no participa
directamente en el mecanismo sino que influye en el
microambiente del centro activo. Los residuos tirosina 34
y serina 82 no tienen un papel decisivo en este proceso.
También fue evaluada la resistencia a la temperatura de
todas las especies enzimáticas, obteniendo la curva de
inactivación y calculando el factor entrópico y entálpico de
cada variante. En todos los casos la inactivación siguió una
cinética de primer orden, con una temperatura de
inactivación media de 80 0C, que no varió
significativamente para los mutantes (79 0C, 81 0C), lo que
evidencia que dichas sustituciones no afectan la alta
resistencia a la temperatura de la enzima nativa, aunque
H143 presentó el menor valor de factor entálpico y la
menor temperatura de inactivación media que fue de 77
0C. De este experimento puede concluirse que la glutamina
143 también influye en la alta resistencia de la enzima a la
inactivación por calor, al parecer por la estabilización de la monomérico de hSOD1, F50E/G51E, presenta una
conformación. Una tirosina en esa posición aumenta
ligeramente la inactivación y una serina la disminuye, pues
parece influir de forma positiva, en el establecimiento de
una nueva conformación resistente a la temperatura (32).
Igualmente se verificó la influencia de estos residuos
en la fosforilación de la enzima, principal mecanismo de
regulación de la misma. Por reacción con quinasas in vitro,
se identificó la serina 82 como blanco de esta
modificación, pues no se detectan especies fosforiladas del
mutante S82A-Q, sólo de la enzima nativa. Esta
modificación de la serina 82 podría constituir un blanco de
regulación importante, debido al grado de conservación
que posee en otras SOD (32).
Otro aporte importante y reciente en este campo es
realizado por Candas D. et al. en 2013 (33), quienes
obtienen un mutante de la SOD2 denominado S106A, en el
cual remplazan la serina 106 por alanina para evaluar el
papel de dicho residuo en el reconocimiento por el
complejo CyclinB1/Cdk1. Esta investigación toma como
antecedentes algunos estudios de caracterización de la
Cdk1, donde se han identificado determinados residuos de
serina que constituyen sitios de fosforilación dentro de una
secuencia consenso, en numerosas proteínas citosólicas
que Cdk1 reconoce a nivel de dicha secuencia, mediante la
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Mario Riera Romo
cual ejerce su regulación por fosforilación, implicacada en
múltiples procesos celulares (34, 35).
Análisis de estructura-función del mutante S106A,
muestran como principales resultados la reducción de la
actividad SOD2 en células murinas de músculo esquelético
y cardíaco, extraídas de animales irradiados y transfectadas
con S106A, respecto células control de los propios
animales sometidos al mismo tratamiento, pero que
expresan la SOD2 nativa, en las cuales la actividad
representó el doble. También logran correlacionar dicha
disminución con la inhibición de la fosforilación, mediante
ensayos de detección de SOD2 fosforilada, por Western
Blott, los cuales revelaron una disminución de la especie
fosforilada de la enzima en las células transfectadas. Estos
hallazgos en su conjunto, sugieren que la sustitución de la
serina 106 por alanina en la SOD2 afecta el
reconocimiento y la fosforilación por Cdk1, lo que
disminuye la actividad enzimática, debido a que este
residuo es requerido para la activación por modificación
covalente de la SOD2 mediada por el complejo
CyclinB1/Cdk1 (33).
Igualmente se han realizado investigaciones basadas en
la obtención de quimeras entre isoformas de la SOD (36),
que han permitido evaluar su función y dilucidar
elementos estructurales de la SOD3 o SOD extracelular,
entre los que se encuentran la demostración de la forma
tetramérica activa para la SOD3 y su afinidad por heparina
y heparán sulfato.
Estos investigadores logran expresar y purificar con un
alto rendimiento, un mutante de la hSOD1 y la quimera
hSOD1/3 (PseudoEC-SOD). El doble mutante
reducción de la actividad específica en un 90 % respecto a
la enzima nativa, lo que demuestra la importancia de la
fenilalanina 50 y la glicina 51 para la actividad de la
hSOD1, las cuales a diferencia de las histidinas, no están
directamente involucradas en el mecanismo catalítico sino
que se encuentran expuestas en la interfaz de contacto
entre monómeros de hSOD1.
Este experimento permite también determinar que el
dímero está estabilizado por fuerzas hidrofóbicas y de van
der Waals, pues la introducción de ácido glutámico, que es
polar y cargado, en la interfaz de dimerización (en el doble
mutante) reduce la actividad específica.
Dicho resultado se repite para la quimera triple mutante
de PseudoEC-SOD, V24D/F50E/G51E, con la cual se
confirma el papel de los residuos de fenilalanina y glicina
en este caso para la heterodimerización, y además se
comprueba que la sustitución de un aminoácido apolar
alifático como la valina por uno polar con carga negativa
como el ácido aspártico, reduce drásticamente la actividad
catalítica, pues afecta la heterodimerización requerida para
la dismutación de aniones superóxido (36).
También se ha estudiado el plegamiento específico del
monómero de la enzima, el grado de exposición de ciertos
residuos y cómo influyen sobre los mismos diferentes
factores, empleando una técnica novedosa basada en la
introducción de aminoácidos fluorescentes obtenidos por
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