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JAVIER BERNÁCER Y COLS. ANAL. REAL ACAD. NAC. FARM.

Técnicas histoquímicas e inmunohistoquímicas

Técnica histoquímica de la NADPH-diaforasa (NADPH-d)

Varios cortes seleccionados en distintos niveles anteroposteriores
del estriado humano fueron procesados para la visualización de la
actividad enzimática de la NADPH-d, según hemos explicado ante-
riormente (9). Después, los cortes fueron lavados en PB y montados
en portas gelatinizados. Tras dejarlos secar al aire durante una no-
che, fueron deshidratados mediante pasos sucesivos en alcoholes de
concentración creciente, aclarados en tolueno y cubiertos con DPX.
Algunos cortes sirvieron como controles negativos, incubándolos en
un medio carente de ß-NADPH, sin mostrar ningún tipo de marcaje.

Técnica inmunohistoquímica simple

Otra serie de cortes que abarcaba los distintos niveles estriatales
fue tratado inmunohistoquímicamente para visualizar las neuronas
colinérgicas por medio de la enzima colina acetiltransferasa (ChAT).
Después de tres lavados de 10 minutos en PB salino (PBS), los cortes
fueron tratados con una solución formada por un tercio de etanol y
dos tercios de agua oxigenada al 3% en PBS durante 30 minutos, con
el fin de inactivar la actividad de la peroxidasa endógena. Tras otros
tres lavados en PBS, los cortes fueron incubados en una solución
con su anticuerpo primario (1:500, 2 noches) generado en cabra,
incluyendo PBS como tampón y Tritón X-100 al 0,1%. Después de
varios lavados en PBS, los cortes fueron de nuevo incubados durante
90 minutos a temperatura ambiente en la solución que contenía el
anticuerpo secundario biotinilado correspondiente (Ig G anti-cabra
generado en conejo; Vector Labs, Burlingame, EE UU), a una dilu-
ción 1:250. Después, y tras varios lavados en PBS, los cortes fueron
sumergidos durante 90 minutos a temperatura ambiente en una
solución al 1:125 de complejos avidina-biotina-peroxidasa (ABC,
Vector Labs). Los cortes fueron revelados al situarlos en un medio
con un 0,05% de 3,3’-diaminobenzidina (DAB, Sigma) y un 0,003%
de H2O2 en tampón Tris al 0,05 M, pH 7,6. Algunos cortes sirvieron
como control negativo omitiendo el anticuerpo primario o el secun-
dario en las distintas soluciones.

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