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VOL. 66, (2) 2000-05-17 RECEPTORES NICOTÍNICOS NEURONALES

que es funcional en la terminal presináptica. La afinidad por la
epibatidina, con una EC50 de 60 pM (¡6 x 10-11M!) sin necesidad de
eliminar la acetilcolina presente en el medio, nos da idea de la
peligrosidad de esta substancia como potencial neurotóxico, y de sus
posibilidades como modelo para diseñar nuevos fármacos.

En estas mismas terminales el ATP y los diadenosina polifosfatos
son capaces de activar especificamente sus receptores y provocar la
liberación exocitótica de acetilcolina, solamente cuando el Ca2+ esta
presente en el medio, como se muestra en la figura 4-c. Estos resultados
confirman que hay receptores funcionales para nucleótidos y
dinucleótidos en las terminales colinérgicas en lo que se refiere a la
secreción de acetilcolina.

Figura 5.- Estudios de respuesta en sinaptosomas unicos aislados. Respuesta a
nicotina y ApnA. En la imagen de la derecha se observan las terminales nerviosas
pegadas a un cubreobjetos con poli-L-lisina y marcados con anticuerpos anti-
sinaptofisina. La escala de pseudocolor representa la intensidad de F400 (bajo y alto
Ca2+ intrasinaptosomal).
En la gráfica de la izquierda se muestra los cambios de fluorescencia que con respecto
al tiempo sufre la terminal sináptica (indicada en la imagen de la derecha), cuando es
estimulada con Ap5A 100 µM, nicotina 100 µM y K+ 30 mM. Las zonas donde se
aplicaron las diferentes sustancias están indicadas mediante barras sólidas en la parte
superior del registro. Así mismo se tomó una imagen del sinaptosoma analizado en
los momentos previos y posteriores a las diferentes estimulaciones, así como durante
la misma.
Para realizar este estudio, los sinaptosomas fueron cargadas con la sonda fluorescente
FURA-2 durante una hora a 37 Cº. Posteriormente los sinaptosomas fueron limpiados
con una solución salina y montados en una pequeña cámara de perfusión en la platina
de un microscopio Nikon TE-200. Los sinaptosomas fueron excitados a 2 longitudes
de onda diferentes (380 y 400 nm) y la fluorescencia fue recogida a 510 nm (prisma
dicróico de paso de banda, 430 nm) a través de un objetivo Nikon fluor X 100, 1.3
NA. Imágenes de 12 bites fueron tomadas cada 822 mílisegundos (alternativamente a
las dos longitudes de onda a las cuales fueron excitados los sinaptosomas) mediante
una cámara Hamamatsu C4880-80CCD, controlada por el software Kinetic (UK). El
registro temporal representa la media de la intensidad de luz en una terminal sináptica
delimitada por una región elíptica.
Posteriormente los sinaptosomas fueron fijados mediante paraformaldehido al 4%, y
marcados con anticuerpos anti-sinaptofisina de ratón. Posteriormente, se revelaron
con anticuerpos anti-ratón marcados con fluoresceina.

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