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ANALES 2.3.2. Evaluación de apoptosis
RANF Las células sKOV-3 se trataron con cbD en solución (20 y
www.analesranf.com 30 µm) durante 24 y 48 horas. A continuación, las células se levan-
taron, tiñeron con Annexin V-FItc y ioduro de propidio, y se man-
diseñar, desarrollar y evaluar nanopartículas poliméricas de cbD tuvieron en oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos.
eficaces para el tratamiento de cáncer de ovario en monoterapia o Posteriormente, se analizaron mediante el citómetro FAcscan bec-
en combinación con agentes antineoplásicos convencionales. tonDickinson, usA).
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.3.3. Ensayos de migración celular
2.1 Materiales el efecto del cbDsol en la migración de células tumorales
el cbD es de tHc-Pharma (Alemania), y la DOX, cIs y
de ovario se evaluó en las células sKOV-3 (altamente invasiva) me-
PtX, son de Fisher-scientific (españa). el resómero de PLGA-rG®- diante:
502 (PLGA-502) (v.i. 0.16–0.24 dL/,) de evonik®(Alemania) y el
alcohol polivinílico de sigma-Aldrich (usA). el ácido fólico y todos Ensayo de “cierre de la herida”
los reactivos de funcionalización son Fisher-scientific (españa). todos Las células se sembraron en placas Ibidi de 8 pocillos a
los solventes orgánicos utilizados (etanol, metanol, acetonitrilo y una densidad de (55000 células/pocillo). tras 24 horas, las células,
diclorometano) son grado HPLc (Fisher-scientific, españa). el re- completamente confluentes, se trataron con mitomicina-c (25
activo mtt es de sigma-Aldrich (usA). el medio de cultivo rPmI- µg/ml) durante 30 minutos para inhibir la proliferación celular. en
1640- GlutamAX™-I, la tripsina (0.25 %), gentamicina (10 mg/ml), la monocapa celular se generó un hueco con una pipeta de 200 µLy
glutamina y la matriz extracelular Geltrex® son de Gibco (Life- se trataron con cbD (5 y 15 µm) durante 24 horas. A diferentes
technologies, usA). el suero bovino fetal es de biowest (Francia) y tiempos (0, 12 y 24 horas) las células se fotografiaron para evaluar
el kit de apoptosis con Annexin-V FItc ioduro de propidio (V13242) la migración celular a través del hueco generado, determinando el
de Invitrogen (Life-technologies, usA). área del hueco a cada tiempo mediante el software Image J. La ca-
pacidad migratoria de las células (%) se determinóde manera re-
2.2 Cultivos celulares lativa con respecto al control (células tratadas con medio de cultivo)
Las líneas celulares sKOV-3 y OAW-42 de cáncer de ovario utilizando la siguiente ecuación (29):
son de American type culture collection (Atcc) y de european co- Donde A0 es el área del hueco generado a t=0 y At el
llection of Authenticated cell cultures (ecAcc) respectivamente. Las área a t= 6 o 24 horas.
células se mantuvieron a 37 ºc con un 5 % de cO2, utilizando rPmI-
1640 enriquecido con glutamina (200 mm) y rPmI-1640 Gluta- Ensayo de migración Transwell
mAX™ como medio de cultivo para la células OAW-42 y sKOV-3 Las células se sembraron en insertos transwell (8 µm de
respectivamente. el medio de cultivo se suplemento con suero bovino tamaño de poro) de placas de 24 pocillos (105 células/inserto) (Fal-
fetal (10 % v/v) y gentamicina (1 % v/v). Los experimentos se re- con, usA) y se trataron con cbDsol (15 y 30 µm) durante 24 horas.
alizaron entre los pases celulares 5-30. Las células presentes en la parte superior del inserto se eliminaron
con una torunda de algodón. Las células que migraron a la parte
2.3. Actividad antitumoral in-vitro del CBDsol inferior del inserto se fijaron con metanol y se tiñeron con cristal
2.3.1.Estudios de viabilidad celular violeta (0.1 % v/v). tras varios lavados, el cristal violeta se extrajo
La actividad antiproliferativa del cbDsol se evaluó en las con una solución de ácido acético al 10 % y la absorbancia se midió
a 595 nm. Paralelamente, se llevó a cabo un ensayo de viabilidad
células OAW-42 y sKOV-3. Las células se sembraron en placas de 96 celular (105 células/ pocillo en placas de 24 pocillos) para corregir
pocillos (1.5 104 células/ cm2) y se trataron (24 horas después) con los resultados del experimento de migración celular.
cbDsol (6.25-50 µm) durante 24 y 48 horas. La viabilidad celular Finalmente, se calcularon los porcentajes de migración ce-
se determinó mediante mtt. como control negativo y positivo de lular, expresados de manera relativa con respecto al control (100
muerte celular se emplearon células tratadas con medio de cultivo %).
y triton-X (1 % v/v), respectivamente. La solución patrón de cbD
se preparó en etanol absoluto (20 mm) y se diluyó con medio de
cultivo. se calcularon los valores de cI50 de cbD utilizando el pro-
grama compusyn-software (combosyn, ,usA). en células sKOV-3
también se evaluó el efecto de concentraciones bajas de cbD (100-
1000 nm) tras 24, 48 y 72 horas de incubación.
Quimioterapia nanométrica a base de cannabinoides 135
para el tratamiento de tumores ginecológicos
Ana I. Fraguas , Ana I. Torres Suárez, et al
An Real Acad Farm Vol. 86. Nº 2 (2020) · pp. 133-150
