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PATRICIA MARÍN-GARCÍA Y COLS. AN. R. ACAD. NAC. FARM.

RESUMEN

Las determinaciones de glutamato utilizando Amplex Red Glutamic Acid
Assay están afectadas por el agonista P2X BzATP

El compuesto Amplex Red (AR) es el sustrato fluorogénico para la peroxidasa
de rábano (HRP) más estable y sensible. Así, en presencia de peróxido de hidróge-
no (H2O2), el AR (un compuesto no fluorescente) es convertido en resorufina (un
producto fuertemente fluorescente) por la acción de la HRP. En los últimos años
se han realizado muchos ensayos utilizando este compuesto para cuantificar un
variado surtido de análisis, así como para detectar la actividad de muchas y va-
riadas enzimas. Recientemente hemos demostrado que el BzATP, un agonista de
varios receptores ionotrópicos de nucleótidos (P2X), interfiere con la oxidación del
Amplex Red catalizada por la HRP. En el presente trabajo mostramos que las de-
terminaciones de glutamato utilizando el kit Amplex Red Glutamic Acid/Glutamate
Oxidase Assay están fuertemente interferidas por el BzATP. Estos datos son real-
mente interesantes porque demuestran que la fluorescencia de la resorufina, en
presencia del BzATP, no es proporcional a la concentración de glutamato y, por
lo tanto, no debe ser utilizada como un método para medir la concentración de
glutamato.

Palabras clave: Amplex Red.—Glutamato.—P2X.—BzATP.—Interferencias.

INTRODUCTION

Amplex Red (AR) reagent is the most stable and sensitive
fluorogenic substrate known for horseradish peroxidase (1). A variety
of novel fluorogenic and chromogenic assays for enzymes that
produce hydrogen peroxide has been developed using this compound.
Thus, these coupled assays permit the ultrasensitive quantitation of
a diverse assortment of analytes, including glucose, galactose,
cholesterol, glutamic acid, xanthine (or hypoxanthine), uric acid,
choline, acetylcholine and hydrogen peroxide, as well as to detect
the activity of many different enzymes (e.g. phospholipase D,
phosphatidylcholine-specific phospholipase C, sphingomyelinase, ...)
(Table 1).

We recently have reported that the precision of such
determinations are affected by the presence in the medium of the
ATP analog, BzATP (2‘-3‘-o-(4-benzoylbenzoyl)-adenosine 5‘-
triphosphate), an agonist of the ionotropic P2 receptors, P2X1, P2X2,

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