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ARMIN WOLF ANAL REAL ACAD. FARM.

without any observable enzyme leakage, which indicated the integrity of the outer cell
membrane. After 20 hours of CsA incubation apoptosis parameters were further
increased and were accompanied by the increased activity of the cysteine protease,
caspase-3 (CPP 32), and slightly increased caspase-6 (Mch 2), but not caspase-1 (ICE).
The specific caspase-3 inhibitor, Ac-DEVD-CHO, inhibited caspase-3 activation and
attenuated CsA-induced apoptosis and LDH leakage. The caspase-6 inhibitor, Ac-VEID-
CHO, only marginally inhibited CsA-induced apoptosis. Decreased mitochondrial
membrane potential and cytochrome c release went in parallel with ultrastructural
mitochondrial changes and might be regarded as early events which trigger the apoptosis
cascade. Transmission electron microscopy (TEM) confirmed an increase in the number
of necrotic cells after 20 hours, but not after 4 hours, compared with controls.

Key words: Apoptosis.- Ciclosporine A.- Mithochondrial membrane potencial.-
Caspases.- DNA fragmentation.

RESUMEN

Inducción de Apoptosis in vitro en hepatocitos de rata por ciclosporina A

La cefalosporina A (CsA) se utiliza frecuentemente en hepatocitos de rata y
fracciones mitocondriales hepáticas aisladas como inhibidor específico de la liberación
de Ca2+ y como bloqueador selectivo de la permeabilidad y del potencial de membrana
mitocondriales, procesos implicados en la inhibición de la apoptosis. Sin embargo, hasta
ahora no se ha descrito ni la inhibición ni la inducción de apoptosis por CsA en cultivos
primarios de hepatocitos de rata tras su incubación por un periodo de 4 a 20 horas. El
propósito de este estudio ha sido examinar con criterios morfológicos y bioquímicos los
efectos de la CsA sobre la apoptosis y esclarecer las características de los mecanismos
subyacentes.

Los hepatocitos de rata se cultivaron durante 4-20 h. con CsA a concentraciones
de 0, 10, 25 y 50 µM. Se investigaron los fenómenos de condensación y fragmentación
de la cromatina, fragmentación de ADN (TUNEL), distribución de fostatidilcolina en la
membrana (Anexina V), así como la actividades enzimática de caspasas 1, -3 y –6, el
potencial de membrana mitocondrial (Rhodamina 123) y la liberación de citocromo C en
el citosol.

Tras cuatro horas de incubación con CsA, la condensación y fragmentación de
la cromatina y el número de células TUNEL y Anexina V positivas aumentaron en
función de la dosis sin que se observara pérdida enzimática, lo que indica la integridad
de la membrana celular externa. Después de 20 horas de incubación con CsA,
experimentaron un mayor incremento acompañado del aumento de las actividad de
cistein-proteasa, caspasa-3 (CPP32) y de un ligero incremento de caspasa-6 (Mch 2),
pero no de caspasa-1 (ICE). El inhibidor específico de caspasa-3, Ac-DEVD-CHO,

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