1.INTRODUCCIÓN

La utilización del agua mineral natural como medicamento se viene haciendo en el mundo desde hace siglos. La primera publicación sobre este tipo de agua se debe a Savoranola, quien en 1498 publica la obra “De Balneis et Thermis”, considerado el primer tratado sobre las aguas mineromedicinales, de igual forma aparecen los tratados de Brancaleone (1498), Adria (1536) y Fallopio (1546). Posteriormente, en 1571, Andrea Bacius recoge en su libro “De Termis” las características y efectos de las aguas mineromedicinales, considerada una de las más importantes obras sobre el tema [1,2,3]

La primera publicación en el idioma español que se conoce sobre las aguas mineromedicinales fue realizada por el catedrático de la Universidad de Alcalá de Henares, Limón Montero en el año de 1697, quien define en ese escrito lo que en ese momento se llegó a denominar agua mineromedicinal [4].

Para Limón Montero, el agua mineromedicinal era aquella que recibe extrañas virtudes de los minerales que la conforman y es utilizada como medicamento [4]. Esta definición se mantuvo hasta que la hidrología médica, como resultados de las investigaciones científicas realizadas, logro establecer los principios científicos que sustentaron las nuevas definiciones sobre las aguas mineromedicinales.

En España, el catedrático de la Universidad Complutense de Madrid, Dr. Manuel Armijo define las aguas mineromedicinales como aquellas que brotan de una fuente y pueden ser utilizadas directa- mente en terapias dado a que son reconocidas por los entes nacionales de salud como verdaderos medicamentos [5].

Las aguas mineromedicinales son utilizadas en Asia y en Europa desde hace siglos con fines terapéuticos en establecimientos balnearios. En la actualidad, esta forma de tratamiento ha ganado muchos adeptos, constituyendo una floreciente industria en estos continentes. En Europa, en países como Alemania, España, Francia y Portugal, existe una cultura del uso de las fuentes de agua mineromedicinales con fines curativos, para tratar múltiples enfermedades, incluyendo artritis reumatoide, fatiga muscular, gota, problemas dermatológicos, trastornos circulatorios, digestivos, respiratorios y otras afecciones de la salud, todo ello de acuerdo a la composición química de las mismas, lo que ha resultado en una pujante industria de salud, donde cada año acuden miles de personas para buscar alivio a sus diferentes dolencias [6,7].

Unos de los aspectos menos conocidos de las aguas minero- medicinales a nivel mundial, es lo atinente a las características de población microbiana que las habitas y sus posibles acciones en el ambiente y la salud.

En España, gracias al trabajo que ha venido desarrollando la comisión de aguas mineromedicinales de la Real Academia Nacional de Farmacia por varias décadas, se tiene un excelente panorama de la composición química y microbiológica de los principales balnearios de aguas mineromedicinales españoles.

Sin embargo, en el continente americano, específicamente en los países latinoamericanos, a pesar de que las culturas ancestrales, como la de los aztecas, incas y mayas (camino del Inca), utilizaban las aguas termales de manera cotidiana, hoy en día su utilización como medicamento es limitado, y cuando se utilizan se hace en la mayoría de los casos de una manera empírica sin ningún tipo de rigor medico ni farmacológico. En estos países la mayoría de los estudios se han hecho abordando los aspectos geológicos, físicos y químicos [8,9,10,11,12,13], desconociéndose en la mayoría, cuál es la composición microbiológica y propiedades terapéuticas.

El estudio de la microbiología de cada manantial tiene un interés sanitario, ya que una contaminación microbiana puede representar un riesgo para la salud de los agüistas y además nos puede indicar el grado de protección de los manantiales, así como también sus propiedades terapéuticas.

Las aguas mineromedicinales se distinguen por su composición química específica, en donde prevalecen las concentraciones de iones como sulfatos, fosfatos, nitratos, carbonatos, bicarbonatos, entre otras sustancias químicas, seleccionando de esta manera la existencia de especies microbianas capaces de sobrevivir en condiciones extremas de concentración de sal, pH y en algunos casos de temperaturas, lo que las hace particularmente atractivas en el estudio de microorganismos extremófilos con posibles aplicaciones biotecnológicas de interés para las industrias farmacéutica, alimenticia, química e incluso con aplicaciones en la biorremediación de compuestos nocivos para el medio ambiente [14,15,16].

Es por ello, que conocer la composición y características de la microbiota presente en las aguas mineromedicinales es importante, no solo por sus implicaciones ambientales y ecológicas en relación con el conocimiento de la composición y función de la biodiversidad microbiana presente, sino también porque tienen repercusiones en la salud de las personas desde dos puntos de vista, por un lado dentro de esta microbiota pueden estar presentes bacterias patógenas que causan enfermedades infecciosas en los usuarios o transmiten genes de resistencia a los antibióticos, y por el otro, también pueden contener bacterias beneficiosas para curar algunos tipos de enfermedades o que producen metabolitos con importantes propiedades biotecnológicas, medicinales o industriales [17,18].

En Ecuador, se puede indicar que existe una gran cantidad de conocimiento ancestral en el uso de aguas termales como una terapia alternativa para curar varios tipos de enfermedades. La presencia de aguas termales asociadas con la presencia de volcanes ha sido utilizada desde la antigüedad por personas de diferentes grupos étnicos que habitan en esta área, que acuden a ellos para aliviar diversas dolencias, y en los últimos años se han convertido en un turismo atractivo [11]. Sin embargo, aún se desconoce cuál es la biodiversidad de la microbiota asociada con la mayoría de estos entornos y su papel y las posibles propiedades ambientales, biológicas y ecológicas.

Los primeros estudios que se han realizado en Ecuador sobre la microbiología de las aguas mineromedicinales han sido llevados a cabo gracias al trabajo de cooperación universitaria entre el grupo de investigación de microbiología del agua de la Universidad de los Andes en Venezuela y los grupos de investigación en microbiología y biotecnología ambiental de la carrera de Ingeniería Ambiental de la Universidad Central del Ecuador (UCE) y el grupo de investigación en microbiología de la carrera de Bioquímica y Farmacia de la Escuela Superior Politécnica del Chimborazo (ESPOCH), todo ello gracias al apoyo financiero de la Dirección de investigación y postgrado de la UCE y del Instituto de Investigación de la ESPOCH.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 MATERIALES

2.1.1 Sitio de muestreos

La presente investigación se llevó a cabo en las aguas mineromedicinales del Balneario Urauco en la Parroquia Lloa, perteneciente a la Ciudad de Quito, Provincia de Pichincha a una altitud de 2773 msnm en las faldas del volcán Guagua Pichincha, a 30 minutos de la parroquia Lloa, la misma que pertenece a la ciudad de Quito. Provincia de Pichincha, Ecuador (Ver figura 1).

Esta fuente de agua mineromedicinal es de origen volcánico, de tipo sulfatada, magnésica e hipertermal [9,10].

El balneario de aguas mineromedicinales de Urauco tiene dos depósitos, el uno forma un manantial natural (Ver figura 2)

y el otro una piscina termal con el punto de surgencia del agua termal en el centro de la piscina (Ver figura 3), en cada uno de ellos se estableció un punto de muestreo.

2.1.2 Muestras

Para la toma y transporte de las muestras se siguieron las normas ecuatorianas INEN 2 169-98 y INEN 2 176-98 [19,20]

Las muestras de agua mineromedicinal se recolectaron en dos épocas diferentes del año durante un periodo de dos año.

En cada ocasión, se tomaron 2 muestras de agua de 1 litros, recogidas en recipientes estériles de plástico, los cuales se trasladaron a temperatura ambiente y en la oscuridad al laboratorio, realizándose los análisis microbiológicos antes de las 24 horas.

2.1.3 Medios de cultivo

Los medios de cultivo utilizados se prepararon a partir de las formas deshidratadas suministradas por las casas comerciales o mezclando los constituyentes del medio, de acuerdo con la formula correspondiente. Se reconstituyeron con agua destilada y posteriormente se esterilizaron en autoclave 120 °C durante 20 minutos a 15 PSI de presión.

2.2.MÉTODOS

2.2.1. Cuantificacion, siembra y aislamiento de bacterias heterótrofas viables

La cuantificacion, siembra y aislamiento de bacterias heterótrofas viables se realizó tanto, por la técnica de filtración por membrana de 0,22 µm [21]. Se utilizo el medio agar R2A [22] y el medio agar extracto de levadura [23], incubando en ambos casos a 37° C durante cuatro días. El volumen de muestra de agua filtrada fue de 100 mL. Los resultados se expresaron como medias aritméticas de las Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (UFC/mL). Las colonias más representativas y con morfología diferente se aislaron en agar soya tripticasa (AST) para su posterior identificación [1].

2.2.2 Identificación de bacterias heterótrofas viables

Las colonias aisladas de bacterias se identificaron por características morfológicas, fisiológicas y bioquímicas. Las pruebas se realizaron según lo indicado por Barrow y Feltham (2004) y MacFaddin (2004), complementadas con las pruebas bioquímicas contenidas en los kit de identificación bacteriana de las galerías API (BioMérieux) y Microgen (Microgen corp.) [24,25].

Entre las pruebas realizadas estuvieron:

Tinción de Gram, morfología de la colonia y producción de pigmento, producción de oxidasa, producción de la catalasa, oxidación-fermen- tación de la glucosa, observación de la movilidad, crecimiento en medio Kligler, producción de indol, producción de acetilmetil carbinol (Voges- Proskauer), prueba del rojo de metilo, utilización del citrato, produc-ción de ureasa, desaminación de la fenilalanina, reducción de nitratos, producción de gas de la lactosa, hidrólisis de la esculina, crecimiento en agar MacConkey, producción de pigmentos, crecimiento a 42° C, observación de la morfología y posición de la espora, hidrólisis del al- midón, hidrólisis de la gelatina y crecimiento en agar sangre [24,25].

2.2.3 Criterios de clasificación

Las cepas bacterianas aisladas se han clasificado siguiendo los criterios taxonómicos del Manual de Bergey [26,27,28] y la nomenclatura del Comité Internacional de Sistemática Bacteriana (ICSB) y publicadas en el Internacional Journal of Systematic Bacteriology.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se han analizado diferentes muestras de aguas termales desde el punto de vista microbiológico mediante métodos estandari zados, utilizando cultivo, cuantificación, aislamiento e identificación taxonómica de bacterias. Los resultados obtenidos en la cuantificacion e identificación de las bacterias y hongos presentes en las aguas estudiadas se resumen en las tablas 1 y tabla 2.

3.1  CUANTIFICACIÓN, SIEMBRE Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS HETERÓTROFAS VIABLES

Se encontró que la cantidad de bacterias aerobias mesófilas promedio en el manantial natural fue de 4.60 x 10² UFC/mL, mientras que en el punto de surgencia dentro de la piscina termal estas bacterias se encontraron en menor cantidad con un valor promedio de 1.60 x 10² UFC/mL, al promediar los datos anteriores se registró que el total promedio de bacterias aerobias heterótrofas en el balneario Urauco fue de 3.1 x 10² UFC/mL, tal como se detalla en la tabla 1.

Los ambientes de las aguas mineromedicinales presentan micoorganismos adaptados a las condiciones adversas de temperatura. Así, los dos puntos analizados en el balneario Urauco presentan una considerable cantidad de bacterias heterótrofas, pero con diferencias significativas en cada punto analizado. Al observar la tabla 1 la diferencia de bacterias aerobias mesófilas entre el manantial natural del agua termal (4.6 x 10² UFC/mL) y el punto de emergencia dentro de la piscina (1.6 x 10² UFC/mL) es de 3,0 x 10²/mL esta diferencia se pudo deber a la ubicación y características de cada punto de recolección de las muestras, en el caso del manantial, el agua estaba acumulada y tenía contacto directo con el suelo, vegetación y fauna del lugar, a diferencia de la piscina donde la muestra se recolectó del punto de surgencia que se encuentra dentro de la piscina y está protegido.

Los resultados obtenidos en el contaje de bacterias heterotrofas en las aguas mineromedicinales del balneario “Urauco” son inferiores a los indicados para aguas mineromedicinales de otro balneario ecuatoriano, como lo es el balneario “Santagua de Chachimbiro”, ubicado en la Provincia de Imbabura, en donde se señala una población de bacterias heterótrofas promedio de 1,00 x 10³ UFC/mL [29], así como a los obtenidos para las aguas del balneario Cununyacu ubicado en la provincia de Pichincha, donde se obtuvo valores de bacterias heterótrofas de 1,875 x 10³ UFC/mL [30].

Las diferencias antes señaladas son indicativa que cada agua mineromedicinal es única, ello debido a que las características fisicoquímicas de cada manantial condicionan la sobrevivencia y proliferación de población bacteriana autóctona que se ha adaptado a través del tiempo, a las condiciones reinantes en este ecosistema [31].

Según el boletín oficial de Canarias N° 38, de 1989 orden que regula el régimen técnico sanitario de piscinas, se establece que la cantidad de bacterias aerobias heterótrofas totales debe ser menor a 200 UFC/mL, en cuyo caso el balneario Urauco estaría fuera del límite permitido, la diferencia es que el balneario Urauco no solo está formado por una piscina sino también por un manantial natural y ninguna normativa se ha establecido en Ecuador para este tipo de agua [32].

Por otra parte, si comparamos los valores obtenidos en la cuantificacion de las bacterias heterótrofas, con los obtenidos en otros países, como es el caso de España, donde se han estudiado una gran cantidad y variedad de balnearios mineromedicinales, podemos observar que, en la mayoría de los casos, los valores indicados en este trabajo son mayores a los encontrados en las aguas mineromedicinales españolas [33,34,35,36]. Ello pone de relieve el hecho de que, en España, los acuíferos y las condiciones sanitarias de estas aguas, reciben un control fisicoquímico y microbiológico más estricto, además de contar con normativas para su control [31].

3.2. IDENTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS HETERÓTROFAS VIABLES

Luego de la cuantificacion y aislamiento de las colonias de bacterias crecidas en el medio de cultivo utilizado, se realizó la identificación de cada una de las colonias bacterianas, los resultados se resumen en la tabla 2.
Al analizar la tabla 2, se puede señalar que la mayoría de las cepas bacterianas identificadas fueron bacterias Gram negativas (62,5%) pertenecientes a la clase gamma proteobacterias, estando representadas las bacterias Gram positivas en menor porcentaje (37,5%) y con la prevalencia entre ellas de la clase firmicutes.
En relación con las bacterias Gram negativas, se pudo identificar un total de 40 cepas que resultaron pertenecer a 17 especies, prevaleciendo las especies Aeromonas caviae (9 cepas) y Pseudomonas fluorescens (5 cepas) (Ver tabla 2)

En el caso de las bacterias Gram positivas se logró aislar un total de 24 cepas pertenecientes a 9 especies, donde prevalecieron las especies Bacillus spp (5 cepas) y Staphylococcus saproficticu (4 cepas) (Ver tabla 2).

Los resultados obtenidos en cuanto al porcentaje de bacterias Gram negativas y Gram positivas en las aguas termales del balneario de Urauco son similares a los obtenidos para la mayoría de los manantiales de aguas termales del Ecuador, donde se ha observado un claro predominio en estos ecosistemas de las bacterias Gram negativas [36,37,38,39].

Jacho (2015) en una investigación realizada en las aguas termales del Balneario Rumiloma de la Parroquia Guangopolo Provincia de Pichincha de Ecuador, indica la prevalencia en esas aguas de bacilos Gram negativos con un 73% de aislamiento [40], resultado similar al observado en el presente estudio.

En un estudio realizado por Flores (2011), en aguas mineromedicinales del balneario Santa Apolonia, ubicado en Mérida Venezuela, se indica que en estas aguas prevalecen las bacterias Gram negativas sobre las bacterias Gram positivas [41]. Similar resultado se observa en el agua del manantial mineromedicinal del balneario La Mitisús, ubicado de igual manera en Mérida Venezuela [42]
En el caso de los estudios microbiológicos realizados a las aguas mineromedicinales españolas, se ha indicado también que en la mayoría prevalecen las bacterias Gram negativas [35,36,43,44].

En todos los estudios de microbiología de las aguas de balearios anteriormente descritos predominaron los bacilos Gram negativos al igual que en el balneario de aguas termales Urauco, lo cual pudiera explicarse por la versatilidad metabólica que exhiben las bacterias Gram negativas que le permiten sobrevivir en ecosistemas oligotróficos mesotermales [31,45].

Respecto a los resultados obtenidos en la identificación de las especies bacterianas aisladas, se puede señalar que el manantial es un ambiente con una gran diversidad biológica debido a la variedad de géneros y especies encontradas prevaleciendo entre ellas las bacterias de la clase gamma proteobacterias (Ver tabla 2).

Dentro de las bacterias pertenecientes a la clase gamma proteobacterias aisladas, destaca la presencia del género Aeromonas quien se aisló en mayor frecuencia y proporción en la piscina y en las aguas del balneario Urauco en general (Ver tabla 2).
Especies del género Aeromonas se han aislados en diversos manantiales de aguas termales mineromedicinales de Ecuador, España y en otros lugares del mundo [33,37,42,46].

Entre los trabajos realizados en el Ecuador donde se han aislados especies de Aeromonas de manera preponderante, resalta el realizado por Maca en el año 2015 en aguas termales del balneario ecológico “Santa Ana”, ubicado en el cantón Baños de Agua Santa de la provincia de Tungurahua. En este estudio se pudo aislar e identificar las especies Aeromonas eucrenophila, Aeromonas media, Aeromonas schubertii y Aeromonas caviae, en los diversos puntos de muestreos analizados [47].

Los miembros del genero Aeromonas son bacterias cuyo hábitat principal son los ecosistemas acuáticos de agua dulce y saladas. Estas bacterias se han indicados que pueden infectar a los organismos acuáticos, así como a humanos, donde se le considera como un patógeno oportunista [48].

Otros de los géneros bacterianos pertenecientes a la clase de las gamma proteobacterias identificados en las aguas termales del balneario Urauco fueron Budvicia, Citrobacter, Edwardsiella, Ewingella, Proteus, Pseudomonas, Psychrobacter, Vibrio y Yokonella (Ver tabla 2).
Los géneros antes mencionados pertenecientes a la clase de las gamma proteobacterias han sido aislados en diversos tipos de ecosistemas acuáticos, tanto de aguas dulces como de aguas minerales naturales y termales en diferentes lugares del mundo [1,30,36,37,42,45].
En Ecuador Ibaza en el año 2018 señala la presencia de bacteria de los géneros Aeromonas, Budvicia, Citrobacter, Ewingella, Pseudomonas, Psychrobacter en las aguas termales del balneario de “Santagua de Chachimbiro” en la Provincia de Imbabura. Resultado muy similar al obtenido en la presente investigación [29].

Las bacterias del género Vibrio han sido observadas como parte de la microbiota autóctona en diversos manantiales de aguas mineromedicinales ya que resisten una elevada osmolaridad dado a que poseen complejos mecanismos de regulación interna [49].
En relación con la especie de bacterias Gram negativas de los géneros Acidovorax y Brevundimonas perteneciente a las alfa proteobacterias y beta proteobacterias, respectivamente, las cuales se aislaron también de las aguas termales del balneario Urauco, se pude indicar que las mismas se han aislado de otros manantiales de aguas minerales termales, tanto de Ecuador, España y Venezuela [29,37,42,50]
En el caso de Acidovorax delafieldii, anteriormente conocida como Pseudomonas delafieldii, es una bacteria comúnmente aislada del suelo y en ocasiones del agua, así lo demostraron Guobin y colaboradores en el año 2005, aislando esta bacteria a partir de las muestras de aguas residuales del campo petrolífero Shengli en China [51].

Con respecto a las bacterias Gram positivas encontradas en el agua termal del balneario Urauco, destaca la prevalencia de microorganismos pertenecientes a la clase firmicutes, con los géneros Bacillus, Enterococcus, Kurthia y Staphylococcus, seguidos de individuos de las clases de Actinobacterias con los géneros Corynebacterium y Micrococcus (Ver tabla 2).
Las bacterias Gram positivas son más comunes en aguas hipertermales, aunque también se han aislados en aguas meso termales e incluso hipotermales [31,45].

En el estudio de las aguas termales del balneario “Santa Ana” de Baños de Agua Santa, perteneciente a la provincia de Tungurahua se logró identificar bacterias Gram positivas de los géneros Bacillus, Corynebacterium, Kurthia y Staphylococcus [38], resultados similares a los que se pudo identificar en el presente trabajo.

De igual forma, en el estudio de la biodiversidad microbiana de las aguas termales “Santagua de Chachimbiro” en la Provincia de Imbabura, se logró aislar e identificar de bacterias Gram positivas de las especies Bacillus cereus, Bacillus mycoides, Bacillus stearothermophilus, Bacillus thuringiensis y Micrococcus lylae [29], resultado coincidente con el obtenido en las aguas del balneario Urauco.

En cuanto al género Bacillus, estas bacterias provienen del suelo de donde pasan al agua, aunque son más comunes en aguas hipertermales también crecen en aguas meso termales como es el caso del agua del Balneario Urauco y han sido también señaladas en aguas mineromedicinales mesotermales de España [17,33,34,35,36].

Bacterias del género Bacillus se han involucrado en procesos biotecnológico dada a su capacidad de producción de metabolitos con diversas aplicaciones biotecnológicas e industriales, lo cual sería de mucho interés económico [14,15,16].

4. CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos en el presente estudio microbiológico evidencian que el agua termal del balneario Urauco, ubicado en la Provincia de Pichincha Ecuador, presenta una cantidad moderada de bacterias heterótrofas lo cual estaría indicando potenciales problemas de protección de los acuíferos y de contaminacion microbiana por parte del medio ambiente circundante.

Por otra parte, la presencia de bacterias Gram negativas de la clase gamma proteobacterias indican que en Ecuador también se observa, como en España y otros países latinoamericanos, la prevalencia de este tipo de microorganismos en las aguas mineromedicinales mesotermales.
Se ha logrado obtener la identificación de 64 cepas de bacterias pertenecientes a 26 especies dentro de 20 géneros bacterianos, lo cual indica una alta biodiversidad bacteriana para las aguas del balneario Urauco.

En el futuro inmediato, debe llevarse a cabo la metagenómica de estos ecosistemas, así como la construcción de una colección de cultivos para la conservación y mantenimiento de cepas microbianas aisladas, así como el diseño de metodologías para el uso de estos microorganismos en la biorremediación y procesos biotecnológicos.

5. AGRADECIMIENTOS

Este trabajo ha sido posible gracias al financiamiento obtenido por parte de la Dirección de Investigaciones de la Universidad Central del Ecuador, Quito-Ecuador a través del proyecto No. 11 y del Instituto de Investigaciones de la Escuela Superior Politécnica del Chimborazo, Riobamba-Ecuador

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