Diseño y desarrollo de nuevas formulaciones para la vehiculización de genes terapéuticos con aplicación al cáncer de hígado y colon

Resumen

El cáncer es una de las principales causas de muerte en todo el mundo. La liberación de genes terapéuticos vehiculizados en nuevas formas farmacéuticas se presenta como una prometedora alternativa en el tratamiento de esta enfermedad. Los dendrímeros PAMAM son polímeros catiónicos cuya aplicación como vehículos en terapia génica está generando un interés creciente en la comunidad científica. La mezcla de los dendrímeros con DNA lleva a la formación de complejos por interacción electrostática que reducen el tamaño y la carga del DNA, lo protegen de la degradación por las nucleasas del suero y aumentan su entrada en la célula por endocitosis. Sin embargo, la influencia de los aspectos físico-químicos en la eficacia de estos vectores, así como el balance óptimo entre su eficacia y toxicidad no han sido totalmente elucidados. En este trabajo se han empleado dendrímeros de distintos pesos moleculares (14.000 Da y 28.000 Da) y se han asociado a DNA plasmídico en cantidades crecientes. Las formulaciones preparadas con el dendrímero de 14.000 Da presentaron tamaños de partícula de entre 150 y 170 nm, mientras que a las mismas relaciones de carga, los complejos preparados con el polímero de mayor peso molecular presentaron valores menores, de alrededor de 100 nm. El potencial de superficie fue positivo en todos los casos excepto cuando se utilizó la misma cantidad de polímero y de DNA (punto de electroneutralidad). Además, en este estudio se ha demostrado la capacidad de estas formulaciones para proteger al DNA frente a la degradación por DNAasas independientemente del peso molecular y cantidades utilizadas. Los resultados in vitro en células HepG2 (hepatocarcinoma humano) y CT26 (cáncer de colon murino) sugieren que a mayor peso molecular y a mayor cantidad de dendrímero se obtienen mayores niveles de expresión génica. Por último, señalar que los estudios de toxicidad determinaron una viabilidad celular superior al 80% en todos los casos.

Palabras clave: Terapia génica.—Dendrímeros.—Polímeros.—Galénica.—PAMAM (poliamidoamina).

Abstract

The success of gene therapy is largely dependent on the development of vectors (new pharmaceutical dosage forms) capable of effectively transfering therapeutic genes into cells. One mayor approach in non-viral gene therapy is based on cationic polymers, like PAMAM (polyamidoamine) dendrimers. In the latest years, the growing interest in the use of dendrimers as gene carries has lead into numerous in vitro and less in vivo studies. The combination of DNA with dendrimers forms complexes that reduce the size and the charge of DNA, protects the genetic material against degradation by serum nucleases and enhances the uptake into cells by endocytosis. However, the mechanisms of internalization and the influence of biophysical features in transfection efficacy are not fully elucidated. Moreover, the safe limits in terms of toxicity of dendrimers when condensed with DNA are still not clear. More systematic studies are needed to gain a better understanding of the rules that govern dendrimer-based gene delivery. In this study, we have developed, characterized and optimized nanoparticles composed of PAMAM dendrimers (14.000 Da and 28.000 Da) and plasmid DNA, which can deliver genetic material into tumour cells. The quantities of both components were calculated in order to prepare complexes at charge ratio (+/–) from 1/1 to 10/1 (dendrimer/DNA). The size of the complexes ranged from 150 nm to 170 nm for those prepared with the 14.000 Da dendrimer at charge ratio 2/1 to 10/1. At the same charge ratios, the complexes prepared with the highest molecular weight polymer showed lower values (around 100 nm). The zeta potential was positive in all cases, except for the ratio 1:1 (neutrality point). Complexes prevented nuclease digestion. The protection was observed in both polymer generations at all the charge ratios prepared. In vitro gene expression by complexes was performed in HepG2 cells (human hepatocellular carcinoma) and CT26 cells (murine colon adenocarcinoma). Transfection levels increased with the charge ratio and with the molecular weight with maximum levels at charge ratio 10/1 in both generations. Finally, in vitro toxicity assays showed a viability higher than 80% in all the complexes prepared.

Keywords: Gene therapy.—Dendrimers.—Polymers.—Pharmaceutical.— PAMAM (polyamidoamine).