In Vitro Induction of Apoptosis in Rat Hepatocytes by Cyclosporine A

Abstract

In rat hepatocytes and isolated liver mitochondrial fractions, CsA is often used as a specific inhibitor of mitochondrial Ca2+ release and as a specific blocker of mitochondrial membrane potential and permeability transition (MPT), which are all processes involved in the inhibition of apoptosis. However, neither inhibition nor induction of apoptosis by CsA has yet been described in the rat hepatocyte primary culture during incubation for 4 and 20 hours. It was the purpose of the present study to examine by means of morphological and biochemical criteria the effects of CsA on apoptosis, and to characterize the underlying mechanisms.

Rat hepatocytes were cultured for 4 or 20 hours with CsA at concentrations of 0, 10, 25 and 50 µM. Chromatin condensation and fragmentation, DNA fragmentation (TUNEL), membrane phosphatidylserine distribution (Annexin V), caspase-1, -3 and -6 activity, mitochondrial membrane potential (Rhodamine 123), and cytochrome c release into the cytosol were investigated.

Four hours after CsA treatment, chromatin condensation and fragmentation, and the number of TUNEL- and Annexin V-positive cells increased dose dependently without any observable enzyme leakage, which indicated the integrity of the outer cell membrane. After 20 hours of CsA incubation apoptosis parameters were further increased and were accompanied by the increased activity of the cysteine protease, caspase-3 (CPP 32), and slightly increased caspase-6 (Mch 2), but not caspase-1 (ICE). The specific caspase-3 inhibitor, Ac-DEVD-CHO, inhibited caspase-3 activation and attenuated CsA-induced apoptosis and LDH leakage. The caspase-6 inhibitor, Ac-VEIDCHO, only marginally inhibited CsA-induced apoptosis. Decreased mitochondrial membrane potential and cytochrome c release went in parallel with ultrastructural mitochondrial changes and might be regarded as early events which trigger the apoptosis cascade. Transmission electron microscopy (TEM) confirmed an increase in the number of necrotic cells after 20 hours, but not after 4 hours, compared with controls.

Keywords: Apoptosis.- Ciclosporine A.- Mithochondrial membrane potencial.- Caspases.- DNA fragmentation.

Resumen

La cefalosporina A (CsA) se utiliza frecuentemente en hepatocitos de rata y fracciones mitocondriales hepáticas aisladas como inhibidor específico de la liberación de Ca2+ y como bloqueador selectivo de la permeabilidad y del potencial de membrana mitocondriales, procesos implicados en la inhibición de la apoptosis. Sin embargo, hasta ahora no se ha descrito ni la inhibición ni la inducción de apoptosis por CsA en cultivos primarios de hepatocitos de rata tras su incubación por un periodo de 4 a 20 horas. El propósito de este estudio ha sido examinar con criterios morfológicos y bioquímicos los efectos de la CsA sobre la apoptosis y esclarecer las características de los mecanismos subyacentes.

Los hepatocitos de rata se cultivaron durante 4-20 h. con CsA a concentraciones de 0, 10, 25 y 50 µM. Se investigaron los fenómenos de condensación y fragmentación de la cromatina, fragmentación de ADN (TUNEL), distribución de fostatidilcolina en la membrana (Anexina V), así como la actividades enzimática de caspasas 1, -3 y –6, el potencial de membrana mitocondrial (Rhodamina 123) y la liberación de citocromo C en el citosol.

Tras cuatro horas de incubación con CsA, la condensación y fragmentación de la cromatina y el número de células TUNEL y Anexina V positivas aumentaron en función de la dosis sin que se observara pérdida enzimática, lo que indica la integridad de la membrana celular externa. Después de 20 horas de incubación con CsA, experimentaron un mayor incremento acompañado del aumento de las actividad de cistein-proteasa, caspasa-3 (CPP32) y de un ligero incremento de caspasa-6 (Mch 2), pero no de caspasa-1 (ICE). El inhibidor específico de caspasa-3, Ac-DEVD-CHO, inhibió la activación de caspasa-3 y atenuó la apoptosis inducida por CsA y la pérdida de LDH. El inhibidor de caspasa-6, Ac-VEID-CHO, únicamente inhibió la apoptosis inducida por CsA. El descenso de potencial de membrana mitocondrial y la liberación de citocromo C fueron paralelos a los cambios de ultraestructuras mitocondriales y pudieran considerarse reacciones tempranas que desencadenan la cascada de fenómenos apoptóticos. La microscopia de transmisión electrónica (TEM) confirmó el incremento del número de células necróticas al cabo de 20 horas, pero no tras 4 horas de incubación, en comparación con los controles.

Palabras clave: Apoptosis.-. Ciclosporina A.- Potencial de membrana mitocondrial.- Caspasas.- Fragmentación de ADN.-