Anales RANF

Vanesa Nozal, Alfonso García-Rubia, Concepción Pérez, Ana Martínez, Valle Palomo @Real Academia Nacional de Farmacia. Spain 266 pocillo de ensayo. La mezcla 2X LRK2 / ERM (Lrrktide) se prepara en 50 mM Tris pH 8.5, 0.01% Brij-35, 10 mM MgCl 2 , 1 mM EGTA, 0.02% NaN 3 . La reacción final de la quinasa con un volumen de 10 µL consiste en 3,75 - 70 ng LRRK2 y 200 µM ERM (Lrrktide) en 25 mM de Tris / 7,5 mM HEPES pH 8,2, 0,005% Brij-35,5 mM MgCl 2 , 0,5 mM EGTA, 0.01% NaN 3. Después de 1 hora de reacción de la quinasa, se añaden 5 µL de mezcla de detección. Ensayo enzimático CK1 δ Se utilizó el Kit de Quinasa-Glo de Promega para detectar la actividad de los compuestos frente a los ensayos tamponados de CK1 δ Kinase-Glo utilizando placas de 96 pocillos negras. En un ensayo típico, se añadieron 10 µl de compuesto (disuelto en DMSO a una concentración de 1 mM y diluido de antemano en tampón a la concentración deseada) y 10 µl (16 ng) de enzima a cada pocillo seguido de 20 µ l de tampón con 0,1 % de caseína como sustrato y 4 µM de ATP. La concentración final de DMSO en la mezcla de reacción no excedió del 1%. Después de una incubación de 60 minutos a 30 ºC, la reacción enzimática se detuvo con 40 µl de reactivo Kinase-Glo. La luminiscencia se registró después de 10 minutos utilizando un lector multimodo Fluostar Optima (BMG Labtechnologies Gmbh, Offenburg, Alemania). La actividad es proporcional a la diferencia del ATP total y consumido. Las actividades inhibitorias se calcularon sobre la base de las actividades máximas medidas en ausencia de inhibidor. La CI 50 se definió como la concentración de cada compuesto que reduce un 50% la actividad enzimática con respecto a la que se produce sin inhibidor. 2.3.1. Ensayo enzimático GSK-3 β La enzima GSK-3 β recombinante humana y el sustrato polipéptido prefosforilado se compraron a Millipore (Millipore Ibérica SAU). El ensayo de quinasa Kinase-Glo se obtuvo de Promega (Promega Biotech Ibérica, SL). El ATP y todos los demás reactivos proceden de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). El tampón utilizado en los ensayos contenía 50 mM de HEPES (pH 7.5), 1 mM de AEDT, 1 mM de EGTA y 15 mM de acetato de magnesio. Los ensayos de Kinase-Glo se realizaron en medio tamponado utilizando placas de 96 pocillos negros. En un ensayo típico, 10 µL (10 µM) de compuesto (disuelto en DMSO a una concentración de 1 mM y diluido previamente en el tampón a la concentración deseada) y 10 µL (20 ng) de enzima se añadieron a cada pocillo seguido de 20 µL de disolución tampón de concentración 25 µM sustrato y 1 µM ATP. La concentración final de DMSO en la mezcla de reacción no excedió del 1%. Después de 30 minutos de incubación a 30 ºC, la reacción enzimática se detuvo con 40 µL de reactivo Kinase-Glo. La luminiscencia se registró después de 10 minutos utilizando un lector multimodo Fluostar Optima (BMG Labtechnologies Gmbh, Offenburg, Alemania). La actividad es proporcional a la diferencia del ATP total y consumido. La actividad inhibitoria de cada compuesto se calculó en base a las actividades máximas medidas en ausencia de inhibidor. La CI 50 se definió como la concentración de cada compuesto que reduce un 50 % la actividad enzimática con respecto a la que se produce sin inhibidores. 2.3.2. Ensayo enzimático BACE1 Los ensayos con la enzima BACE1 se realizaron in vitro utilizando FRET. Se utilizó un sustrato peptídico a base de APP (rodamina-EVNLDAEFK-quencher, Km de 20 µM) portador de la mutación sueca y que contiene una rodamina como donante de fluorescencia y un atenuador en cada extremo. El sustrato intacto es débilmente fluorescente y se vuelve altamente fluorescente al sufrir la escisión enzimática. Los ensayos se realizaron en un tampón de acetato de sodio de 50 mM, pH 4,5 y una concentración enzimática final (1 U/mL). El cribado enzimático se realizó a una concentración 10 µM del inhibidor. La mezcla fue incubada durante 60 minutos a 25 ºC en ausencia de luz y luego se detuvo añadiendo una disolución de acetato de sodio 2,5 M. La fluorescencia se midió con un lector de microplacas Fluostar Optima (BMG Labtechnologies Gmbh, Offenburg, Alemania) a 545 nm de excitación y 585 nm de emisión. 2.4. Metodología química click in situ Los fragmentos 1 y 2 se incubaron en 50 µL de una disolución tampón de acetato sódico (50 mM y pH 4,5) a concentraciones de 30 µM y 60 µM. Se añadió la enzima BACE1 a una concentración final de 0,5 µM. Las soluciones se dejaron a temperatura ambiente durante 24 horas y se analizaron con HPLC-MS mediante la detección de modo iónico único centrado en la masa de los triazoles esperados. 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN El principal objetivo del presente trabajo es el diseño y síntesis de moléculas multidiana capaces de modular al mismo tiempo diferentes mecanismos patológicos, tales como la inflamación, la neurodegeneración y la agregación del péptido beta amiloide (A β ), implicados en la enfermedad de Alzheimer. Las proteínas quinasas juegan un papel importante en enfermedades neurodegenerativas ya que muchas de ellas son capaces de fosforilar de manera anormal la proteína tau provocando su agregación en forma de depósitos insolubles y tóxicos para las neuronas (11,12). Dada la amplia experiencia del grupo de investigación en el diseño y síntesis de inhibidores de estas proteínas quinasas, el primer paso para el diseño racional de las moléculas multidiana se centró en la búsqueda de fragmentos en nuestra quimioteca MBC (13). Los fragmentos seleccionados debían ser fácilmente modificables en alguna posición donde no se viera afectada la actividad biológica de la molécula por la introducción de una nueva funcionalidad que pudiera conectar varios fragmentos. En este caso se planteó que el conector elegido podría proporcionar al compuesto final una tercera actividad biológica no presente en los